Question

研究发现，PVY－CP基因位于某种环状 DNA 分子中。将 PVY－CP 基因导入马铃薯， 使之表达即可获得抗 PVY 病毒的马铃薯。 图表示 PVY－CP 重组质粒的构建过程，相关酶切位点如下表。

（1）步骤②选用的 klenow 酶与细胞内的__（填酶的名称）的功能相似。步骤④应选用的限制性核酸内切酶是__________。

（2）若 BamHⅠ酶切的 DNA 末端与 BglⅡ酶切的 DNA 末端连接，连接部位的 6 个碱基对序列为_________，对于该部位，这两种酶_________（填“都能”、“都不能”或“只有一种能”）切开。

（3）若用 Sau3AⅠ切图中所示的质粒（多个），最多可能获得_____________种大小不同的 DNA 片段。

（4）步骤⑤获得的重组质粒通过农杆菌转入马铃薯的原生质体，并诱导形成细胞壁，再转入_________（  A、细胞分裂素多，生长素少   B、细胞分裂素少，生长素多   C、细胞分裂素和生长素比例适合  D、细胞分裂素中等，生长素少）的培养基中培养，形成__，再进行生根培养，获得转基因马铃薯。

（5）可用__的方法，从个体水平检测马铃薯植株中 PVY－CP 基因是否成功表达。

Answer

DNA聚合酶 BglⅡ和SmaⅠ 都不能 7 A 丛状苗 PVY病毒感染

【解析】

基因工程的操作步骤：获取目的基因（基因文库、PCR、人工合成）；构建基因表达载体（含标记基因、启动子、终止子、目的基因、复制原点等）；把目的基因导入受体细胞（显微注射法、农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法、钙离子处理法）；目的基因的检测和鉴定（分子水平和个体水平检测，前者包括DNA分子杂交、分子杂交和抗原抗体杂交；后者如抗虫抗病接种实验）。

（1）步骤②选用的 klenow 酶可以催化脱氧核苷酸结合形成磷酸二酯键，类似于细胞内DNA聚合酶。经步骤③处理后，目的基因一端的黏性末端为-GATC，一端为平末端，故选择限制酶对质粒进行切割时，应该选择SmaⅠ产生平末端，另外需要选择一种可以产生-GATC黏性末端的限制酶进行切割，结合转录的方向可知，应该选择BglⅡ，故需要选择BglⅡ和SmaⅠ对质粒进行切割。

（2）BamHⅠ识别的序列为GGATCC，BglⅡ识别序列为AGATCT，二者切割的末端均为-GATC，二者产生的黏性末端经DNA连接酶处理后，连接的产物为。

两种酶均不能识别重新连接的产物，故均不能对其进行切割。

（3）Sau3AⅠ的识别序列为GATC，图中质粒含有3个Sau3AⅠ的识别位点，用其进行切割可能打开1个切口、2个切口或3个切口，计算可知，Sau3AⅠ切割后最多可能获得7种大小不同的 DNA 片段。

（4）步骤⑤获得的重组质粒通过农杆菌转入马铃薯的原生质体，并诱导形成细胞壁，需要进行组织培养，先转入A、细胞分裂素（利于芽的形成）多，生长素少的培养基中培养，形成丛状苗，再进行生根培养，获得转基因马铃薯。

（5）可用PVY病毒感染马铃薯，观察马铃薯是否患病，从个体水平检测马铃薯植株中 PVY－CP 基因是否成功表达。