图 1 是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图，载体 质粒 P0 具有四环素 抗性基因（tetr）和氨苄青霉素抗性基因（ampr）。请回答下列问题：
（1）EcoR V 酶切位点为
，EcoR V 酶切出来的线性载体 P1 为__________未端。
（2）用 Taq DNA 聚合酶进行 PCR 扩增获得的目的基因片段，其两端各自带有一个腺 嘌呤脱氧核苷酸。载体 P1 用酶处理，在两端各添加了一个碱基为___________ 的 脱氧核苷酸，形成 P2；P2 和目的基因片段在__________酶作用下，形成重组质 粒 P3。
（3）为筛选出含有重组质粒 P3 的菌落，采用含有不同抗生素的平板进行筛选，得到 A、B、C 三类菌落，其生长情况如下表（“+”代表生长，“﹣”代表不生长）。根据表 中结果判断，应选择的菌落是_____（填表中字母）类，另外两类菌落质粒导入情况分别是_____、___________________。
菌落类型 平板类型 | A | B | C |
无抗生素 | ﹢ | ﹢ | ﹢ |
氨苄青霉素 | ﹢ | ﹢ | ﹣ |
四环素 | ﹢ | ﹣ | ﹣ |
氨苄青霉素+四环素 | ﹢ | ﹣ | ﹣ |
（4）为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行 PCR 鉴定。图 2 所示为甲、乙、丙 3 条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR 鉴定时应选择的一对引物是____________。某学生尝试用图中另外一对引物从某一 菌落的质粒中扩增出了 400 bp 片段，原因是_______________。
几丁质是许多真菌细胞壁的重要成分，几丁质酶可催化几丁质水解。通过基因工程将几丁质酶基因转入植物体内，可增强其抗真菌病的能力。回答下列问题：
（1）在进行基因工程操作时，若要从植物体中提取几丁质酶的mRNA，常选用嫩叶而不选用老叶作为实验材料，原因是____________。提取RNA时，提取液中需添加RNA酶抑制剂，其目的是____________。
（2）以mRNA为材料可以获得cDNA，其原理是________________________________________________。
（3）若要使目的基因在受体细胞中表达，需要通过质粒载体而不能直接将目的基因导人受体细胞，原因是________________________________________________________________________（答出两点即可）。
（4）当几丁质酶基因和质粒载体连接时，DNA连接酶催化形成的化学键是____________。
（5）若获得的转基因植株（几丁质酶基因已经整合到植物的基因组中）抗真菌病的能力没有提高，根据中心法则分析，其可能的原因是____________。
真核生物基因中通常有内含子，而原核生物基因中没有，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制。已知在人体中基因A(有内含子）可以表达出某种特定蛋白(简称蛋白A)。回答下列问题：
（1）某同学从人的基因组文库中获得了基因A，以大肠杆菌作为受体细胞却未得到蛋白A，其原因是__________。
（2）若用家蚕作为表达基因A的载体，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用_______作为载体，其原因是_________。
（3）若要高效地获得蛋白A，可选用大肠杆菌作为受体，因为与家蚕相比，大肠杆菌具有________(答出两点即可)等优点。
（4）若要检测基因A是否翻译出蛋白A，可用的检测物质是________(填“蛋白A的基因”或“蛋白A的抗体”）。
（5）艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验为证明DNA是遗传物质做出了重要贡献，也可以说是基因工程的先导，如果说他们的工作为基因工程理论的建立提供了启示，那么，这一启示是______________。
某种荧光蛋白（GFP）在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光，这一特性可用于检测细胞中目的基因的表达。某科研团队将某种病毒的外壳蛋白（L1）基因连接在GFP基因的5′末端，获得了L1-GFP融合基因（简称为甲），并将其插入质粒P0，构建了真核表达载体P1，其部分结构和酶切位点的示意图如下，图中E1~E4四种限制酶产生的黏性末端各不相同。
回答下列问题：
（1）据图推断，该团队在将甲插入质粒P0时，使用了两种限制酶，这两种酶是_________。使用这两种酶进行酶切是为了保证_______________，也是为了保证__________________。
（2）将P1转入体外培养的牛皮肤细胞后，若在该细胞中观察到了绿色荧光，则说明L1基因在牛的皮肤细胞中完成了________和_________过程。
（3）为了获得含有甲的牛，该团队需要做的工作包括：将能够产生绿色荧光细胞的_____________移入牛的____________中、体外培养、胚胎移植等。
（4）为了检测甲是否存在于克隆牛的不同组织细胞中，某同学用PCR方法进行鉴定。在鉴定时应分别以该牛不同组织细胞中的____________（填“mRNA”“总RNA”或“核DNA”）作为PCR模板。
回答下列问题：
（1）博耶（H.Boyer）和科恩（S.Coben）将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达。该研究除证明了质粒可以作为载体外，还证明了___________（答出两点即可）。
（2）体外重组的质粒可通过Ca2+参与的___________方法导入大肠杆菌细胞，而体外重组的噬菌体DNA通常需与___________组装成完整的噬菌体后，才能通过侵染的方法将重组的噬菌体DNA导入宿主细胞，在细菌、心肌细胞、叶肉细胞中，可作为重组噬菌体宿主细胞的是___________。
（3）真核生物基因（目的基因）在大肠杆菌细胞内表达时，表达出的蛋白质可能会被降解。为防止蛋白质被降解，在实验中应选用______________________的大肠杆菌作为受体细胞，在蛋白质纯化的过程中应添加___________的抑制剂。
基因工程中可以通过PCR技术扩增目的基因。回答下列问题。
（1）基因工程中所用的目的基因可以人工合成，也可以从基因文库中获得。基因文库包括________和________。
（2）生物体细胞内的DNA复制开始时，解开DNA双链的酶是________。在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是________。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的________。
（3）目前在PCR反应中使用Taq酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是________。
