Question

紫花苜蓿是世界上最重要的豆科牧草之一，素有“牧草之王”的美称，NHX基因指导合成的蛋白质能将钠离子排出细胞，研究人员将NHX基因导入新疆大叶紫花苜蓿中，提高了转基因植株的耐盐性。请回答下列问题：

（1）利用PCR技术扩增NHX基因时，需要加入的酶为__________________，反应的温度和时间需根据具体情况进行设定，55~60 ℃有利于________________结合到互补DNA链上。

（2）将目的基因导入受体细胞前要将目的基因和运载体相连，作为目的基因的运载体应具备的条件是_________________________________________________（答出三点）。

（3）将NHX基因导入新疆大叶紫花苜蓿的常用方法是___________，该方法中要将目的基因插入到___________________以保证目的基因能整合到宿主细胞的染色体上，检测目的基因是否导入宿主细胞的方法是___________________________，该检测方法利用的原理是______________。

Answer

热稳定DNA聚合酶（或Taq酶） 引物 具有一个或多个限制酶切割位点、能在细胞中自我复制、具有特殊的标记基因 农杆菌转化法 Ti质粒的T―DNA上 DNA分子杂交技术 碱基互补配对原则

【解析】

1.基因工程技术的基本步骤：

（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；

（2）基因表达载体的构建；

（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；

（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术．个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。

2.有关PCR技术的相关知识：

（1）概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。

（2）原理：DNA双链复制的原理。

（3）前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序以便合成一对引物。

（4）过程：①高温变性：DNA解旋过程；②低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开。

（1）PCR技术扩增NHX基因时，需要加入的酶为热稳定DNA聚合酶（或Taq酶）。利用PCR技术扩增目的基因的过程中，复性时两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，复性的温度为55~60 ℃。

（2）作为目的基因的运载体应具备的条件是具有一个或多个限制酶切割位点、能在细胞中自我复制、具有特殊的标记基因等。

（3）将目的基因导入植物细胞的常用方法是农杆菌转化法，该方法中要将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上，以保证目的基因能整合到宿主细胞的染色体上。检测目的基因是否导入宿主细胞的方法是DNA分子杂交技术，该检测方法利用的原理是碱基互补配对原则。