Question

单宁酶是一类能够水解单宁酸生成没食子酸和葡萄糖的水解酶，其可应用于鲜柿脱涩处理，可消除其中的苦涩味。

注：①选择培养基成分：蔗糖、磷酸氢二钾、硫酸镁、琼脂、单宁酸、溴酚蓝

②溴酚蓝在单宁酸环境中为蓝紫色，在没食子酸环境中为黄色

（1）菌种的分离筛选

将从柿子果园所取的土样置于富集培养液的三角瓶中，30℃、摇床培养48h。稀释适量倍数后，采用________法接种于选择培养基上。根据选择培养基的_________________（现象）作为挑取单宁酶产生菌的标志。

（2）粗酶液制备

向培养菌种的三角瓶中按照培养基体积:缓冲液体积=1:1的量加入pH=5.0的柠檬酸柠檬酸钠缓冲液，在28℃条件下摇床震荡，用定性滤纸过滤，所得滤液即为粗酶液。

柠檬酸-柠檬酸钠的作用是____________________。

请写出一种纯化得到单宁酶的方法及其原理_______________。

（3）酶活力测定

从生物体提取出的酶首先要检测酶的活力，以便更好地将酶用于生产实践，该酶活性大小的表示方法是_____________。在鲜柿脱涩的过程中，为了使酶能够被反复利用，可采用______________技术。

Answer

稀释涂布平板法 黄色圈（变色圈）直径的大小 作为缓冲溶液，抵制外界的酸和碱对溶液PH的影响，维持PH基本不变 凝胶色谱法 根据蛋白质分子之间分子大小、吸附性质等差异进行纯化（或电泳法 根据蛋白质之间电荷，分子大小等差异进行纯化）（或透析法 根据蛋白质之间分子大小差异进行纯化） 单位时间内单宁的降解量（或没食子酸或葡萄糖的生产量） 固定化酶（固定化细胞）

【解析】

微生物的筛选需要使用选择培养基，进行稀释时需要无菌水；对微生物进行鉴定时还需要加入鉴别的指示剂；接种最常用的方法是平板划线法和稀释涂布平板法。据此分析作答。

（1）稀释适量倍数后，接种到选择培养基的方法为稀释涂布平板法；由题干信息知“单宁酶能够水解单宁酸生成没食子酸和葡萄糖”且“溴酚蓝在单宁酸环境中为蓝紫色，在没食子酸环境中为黄色”，若存在单宁酶，则会从蓝紫色变为黄色，故可根据黄色圈（变色圈）直径的大小作为挑取单宁酶产生菌的标志。

（2）本实验中柠檬酸柠檬酸钠的作用是作为缓冲溶液，抵制外界的酸和碱对溶液PH的影响，维持PH基本不变；可用凝胶色谱法对单宁酶进行纯化，实验原理是根据蛋白质分子之间分子大小、吸附性质等差异进行纯化。（或电泳法：根据蛋白质之间电荷，分子大小等差异进行纯化）（或透析法：根据蛋白质之间分子大小差异进行纯化）

（3）“单宁酶是一类能够水解单宁酸生成没食子酸和葡萄糖的水解酶”，故该酶活性的大小可用单位时间内单宁的降解量（或没食子酸或葡萄糖的生产量）表示；固定化酶等技术使酶能够重复利用，而且还能提高产品的品质。