Question

CRISPR/Cas9系统基因编辑技术是近年来颇受关的一项新技术。该基因表达系统主要包含引RNA和Cas9蛋两个部分，引导RNA能识别并结合特定的DNA序列，从而引导Cas9蛋白结合到相应位置并剪切DNA，最终实现对靶基因序列的编辑。研究人员试图CRISPR/Cas9系统对水稻产量基因Q基因进行编辑，请回答下列问题：

（1）研究发现，CRISPR/Cas仅存在于原核生物，故需借助__________技术才能在水稻细胞中发挥作用。Cas9蛋白与__________酶的功能相似。

（2）首先依据__________的部分序列设计DNA片段A（负责编码相应引导RNA），再将片段A与含有Cas9基因的质粒B连接，以构建编辑水稻Q基因的CRISPR/Cas9系统基因达载体（如图所示），该过程中需要用到的两类工具酶有________________。

（3）质粒B大小为2．5kb（位点Ⅰ与位点Ⅱ相隔60b），经酶切后的片段A大小为0．5kb（千碱基对），连接形成的表达载体大小为__________kb。

（4）常用农杆菌转化法将目的基因导入水稻受体细胞，依据农杆菌的侵染特点，目的基因将插入到Ti质粒的__________上，经过转化作用，进入水稻细胞，并将其插入到__________，从而使其得以维持稳定和表达。

（5）CRISRP/Cas基因编辑技术有时存在编辑对象出错而造成脱靶，试从引导RNA的角度分析脱靶的原因____________________。

Answer

转基因（DNA重组或基因工程） 限制酶 Q基因 限制酶和DNA连接酶 2.94kb T-DNA 水稻细胞染色体的DNA.上 其他DNA序列也含有与引导RNA互补配对的序列，造成引导RNA错误结合而脱靶

【解析】

1.基因工程的工具：

（1）限制酶：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。

（2）DNA连接酶：连接的是两个核苷酸之间的磷酸二酯键。

（3）运载体：常用的运载体：质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒。

2.将目的基因导入受体细胞的方法有：

将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是农杆菌介导转化技术(农杆菌转化法)，其次还有基因枪法和花粉管通道技术(花粉管通道法)。

将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是显微注射技术。此方法的受休细胞多为受精卵；将目的基因导入微生物细胞： Ca2+处理法。

（1）由于CRISPR/Cas仅存在于原核生物，若要让CRISPR/Cas在真核细胞中起作用，需借助基因工程技术将其转入水稻细胞中才能发挥作用。根据题干信息"Cas9蛋白结合到相应位置并剪切DNA"，说明Cas9蛋白与限制酶的功能相似。

（2）由于是对水稻产量基因Q基因进行编辑，故首先需要依据Q基因的部分序列设计DNA片段A （负责编码相应引导RNA），再将片段A与含有Cas9基因的质粒B连接，以构建编辑水稻Q基因的CRISPR/Cas9系统基因表达载体。构建基因表达载体需要用到限制酶和DNA连接酶。

（3）质粒B大小为2. 5kb (位点l与位点lI相隔60b)，经酶切后的片段A大小为0.5kb (千碱基对)，连接形成的表达载体大小为2.5+0.5-0.06=2.94kb。

（4）常用农杆菌转化法将目的基因导入水稻受体细胞，由于农杆菌的Ti质粒的T-DNA可转移至受体细胞，并整合到受体细胞的染色体DNA上，故可将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上，经过转化作用，进入水稻细胞，并将其插入到水稻细胞染色体的DNA上，从而使其得以维持稳定和表达。

（5）由于其他DNA序列也含有与引导RNA互补配对的序列，造成引导RNA错误结合，从而导致CRISRP/Cas9基因编辑技术会出现编辑对象出错而造成脱靶。