Question

为生产具有特定性能的α-淀粉酶，研究人员从某种海洋细菌中克隆了α-淀粉酶基因（1656个碱基对），利用基因工程大量制备琢α-淀粉酶，实验流程见下图。请回答下列问题：

（1）利用PCR技术扩增α-淀粉酶基因前，需先获得细菌的_________。

（2）为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接，需在引物的____端加上限制性酶切位点，且常在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点，主要目的是________________。

（3）进行扩增时，反应的温度和时间需根据具体情况进行设定，下列选项中_______的设定与引物有关，________的设定与扩增片段的长度有关。（填序号）

①变性温度②退火温度③延伸温度④变性时间⑤退火时间⑥延伸时间

（4）下图表示筛选获得的工程菌中编码α-淀粉酶的mRNA的部分碱基序列：

图中虚线框内mRNA片段包含___个密码子，如虚线框后的序列未知，预测虚线框后的第一个密码子最多有__种。

（5）获得工程菌表达的α-淀粉酶后，为探究影响酶活性的因素，以浓度为1%的可溶性淀粉为底物测定酶活性，结果如下：

缓冲液

50mmol/LNa2HPO4-KH2PO4

50mmol/LTris-HCl

50mmol/LGly-NaOH

pH

6．0

6．5

7．0

7．5

7．5

8．0

8．5

9．0

9．0

9．5

10．0

10．5

酶相对活性%

25．4

40．2

49．8

63．2

70．1

95．5

99．5

85．3

68．1

63．7

41．5

20．8

根据上述实验结果，初步判断该α-淀粉酶活性最高的条件为______。

Answer

基因组DNA 5’ 使DNA片段能定向插入表达载体，减少自连 ② ⑥ 8 13 pH为8．5，缓冲液为50mmol/LTris-HCl

【解析】

据图分析，图示为利用基因工程大量制备α-淀粉酶的过程，目的基因是α-淀粉酶基因，与体构建基因表达载体，然后将目的基因导入大肠杆菌，接着对目的基因进行检测与鉴定，最后利用工程菌培养获得大量的α-淀粉酶产品。

（1）α-淀粉酶基因来自于海洋细菌，因此为了利用PCR技术扩增α-淀粉酶基因，必须先获得细菌的基因组DNA。

（2）目的基因与运载体结合前需要用限制酶对两者进行切割，延伸是在引物的3’端延伸，为了保证目的基因的完整性，因此需在引物的5’端加上限制性酶切位点，且为了使DNA片段能定向插入表达载体，减少自连，常在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点。

（3）进行扩增时，退火温度的设定与引物有关，延伸时间的设定与扩增片段的长度有关。

（4）根据题意分析，虚线框内mRNA片段内含有24个碱基，每3个碱基构成一个密码子，因此包含24÷3=8个密码子；构成mRNA的碱基有4种，若虚线框后的序列未知，预测虚线框后的第一个密码子最多有4×4-3=13种。

（5）根据表格数据分析可知，在pH为8.5，缓冲液为50 mmol/L Tris-HCl的条件下，α-淀粉酶相对活性为99.5%，活性最高。