Question

为了检测高原训练对运动员体内的血红蛋白含量的影响，需要对运动员训练前后的血红蛋白进行提取和分离，其步骤如下：

（1）在红细胞的洗涤操作中，血液离心后结果如图所示，其中血红蛋白位于__________（填“上清液”或“沉淀物”）。洗涤红细胞时，要用相当于红细胞液体体积5倍的___________洗涤红细胞3次，然后加入蒸馏水到原血液体积，再加40%的_____________，搅拌约10 min，使红细胞破裂，释放出血红蛋白。

（2）在样品粗分离操作中，将收集的血红蛋白溶液放在透析袋中进行透析。透析的目的是_______________。

（3）血红蛋白的纯化是通过凝胶色谱法将杂蛋白除去，最后经___________电泳进行纯度鉴定。研究小组用凝胶色谱法分离蛋白质时，相对分子质量___________（填“较大”或“较小”）的蛋白质先从层析柱中洗脱出来。在装填色谱柱时不得有气泡存在，原因是_______________________。

（4）检测结果显示，经过高原训练后，运动员体内血红蛋白含量有了明显升高，试分析其可能的原因______________________。

Answer

沉淀物 生理盐水 甲苯 去除分子量较小的杂质 SDS—聚丙烯酰胺凝胶 较大 气泡会扰乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，使得到的红色带区歪曲、散乱，降低分离效果 高原环境空气稀薄，氧气含量低，血红蛋白含量会增加

【解析】

根据蛋白质的物化理性质：形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、亲和力等千差万别，由此提取和分离各种蛋白质。血红蛋白的提取与分离的实验步骤主要有：（1）样品处理：①红细胞的洗涤（低速短时间离心），②血红蛋白的释放（需要加入蒸馏水和甲苯），③分离血红蛋白（中速长时间离心）。（2）粗分离：①分离血红蛋白溶液，②透析。（3）纯化：调节缓冲液面→加入蛋白质样品→调节缓冲液面→洗脱→收集分装蛋白质。（4）纯度鉴定--SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。凝胶色谱法（分配色谱法）：①原理：分子量大的分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；分子量小的分子穿过多孔凝胶颗粒内部，路程长，流动慢。②凝胶材料：多孔性，多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。③分离过程：混合物上柱→洗脱→大分子流动快、小分子流动慢→收集大分子→收集小分子。洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。④作用：分离蛋白质，测定生物大分子分子量，蛋白质的脱盐等。

（1）血红蛋白在红细胞内，而血液离心后的各种血细胞主要存在于沉淀物中，因此血红蛋白位于沉淀物中。洗涤红细胞时，生理盐水可以保持红细胞不破裂，而5倍体积洗涤3次可以去除杂蛋白，得到更纯的红细胞。加入蒸馏水，红细胞吸水破裂，加入40%的甲苯，溶解红细胞膜，最终使红细胞破裂，释放出血红蛋白。

（2）透析袋能使小分子自由进出，而大分子则保留在袋内，因此透析可以去除相对分子质量较小的杂质。

（3）血红蛋白的纯化是通过凝胶色谱法将杂蛋白除去，最后经SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。分子量大的分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；分子量小的分子穿过多孔凝胶颗粒内部，路程长，流动慢。因此，研究小组用凝胶色谱法分离蛋白质时，相对分子质量较大的蛋白质先从层析柱中洗脱出来。如果凝胶装填得不够紧密、均匀，就会在色谱柱内部形成无效的空隙，使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过，搅乱洗脱液的流动次序，影响分离的效果，因此在装填色谱柱时不得有气泡存在。

（4）高原空气稀薄，氧气含量低，为了利用更多的氧气进行有氧呼吸，运动员体内血红蛋白含量有了明显升高。