Question

生物兴趣小组试图探究山羊的瘤胃中的微生物对尿素是否有分解作用，设计了以下实验，并成功筛选到能降解尿素的细菌（目的菌）。培养基成分如表所示，实验步骤如图所示。请分析回答问题：

KH2PO4	1.4g
Na2HPO4	2.1g
MgSO4•7H2O	0.2g
葡萄糖	10g
尿素	1g
琼脂	15g
溶解后自来水定容到1 000mL

（1）该实验中所用培养基在成分上的特殊要求是___ 。培养基中葡萄糖可以为细菌提供___ 。

（2）实验中所用锥形瓶、试管都必须进行灭菌，常用的灭菌方法是___。图中接种的方法为___ 法，获得单菌落后继续筛选。实验过程中，除了需将接种后的平板放在适宜的环境中培养一段时间，还需设置一在相同条件下培养的“未接种的空白平板”的对照实验，其目的是___。

（3）为进一步确定取自瘤胃中液体的适当稀释倍数，将接种的培养皿放置在37℃恒温培养箱中培养24〜48h，观察并统计具有红色环带的菌落数，结果见下表，其中___倍的稀释比较合适。用该方法统计的细菌数目会比实际数目___（偏大/基本相同/偏小），其原因是___ 。

稀释倍数	10^3	10^4	10^5	10^6	10^7
菌落数	>500	367	248	36	18

Answer

以尿素作为唯一氮源 碳源（和能量） 干热灭菌（或高压蒸汽灭菌） 稀释涂布平板 检查培养基平板灭菌是否合格和培养过程中是否受到污染 106或105 偏小 因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落（一个菌落可能是一个或多个菌体增殖形成）

【解析】

1、微生物培养基一般都含有水、碳源、氮源、无机盐，此外还要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。对异养微生物来说，含C、N的化合物既是碳源，也是氮源，即有些化合物作为营养要素成分时并不是起单一方面的作用。

2、两种纯化细菌的方法的比较

优点

缺点

适用范围

平板划线分离法

可以观察菌落特征，对混合菌进行分离

不能计数

适用于好氧菌

稀释涂布平板法

可以计数，可以观察菌落特征

吸收量较少，较麻烦，平板不干燥效果不好，容易蔓延

适用于厌氧，兼性厌氧菌

3、消毒和灭菌

消毒

灭菌

概念

使用较为温和的物理或化学方法杀死物体表面或内部的部分微生物（不包芽孢和孢子）

使用强烈的理化因素杀死物体内外所用的微生物（包括芽孢和孢子）

常用方法

煮沸消毒法、巴氏消毒法、化学药剂消毒法、紫外线消毒法

灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌

适用对象

操作空间、某些液体、双手等

接种环、接种针、玻璃器皿、培养基等

（1）该实验需要筛选到能降解尿素的细菌，因此所用培养基在成分上的特殊要求是以尿素作为唯一氮源；培养基中葡萄糖可以为细菌提供碳源。

（2）实验中所用锥形瓶、试管都必须进行灭菌，常用的灭菌方法是干热灭菌或高压蒸汽灭菌。图中接种的方法为稀释涂布平板法，获得单菌落后继续筛选。实验过程中，除了需将接种后的平板放在适宜的环境中培养一段时间，还需设置一在相同条件下培养的“未接种的空白平板”的对照实验，其目的是检查培养基平板灭菌是否合格和培养过程中是否受到污染。

（3）观察并统计菌落数应选30-300之间的培养皿进行统计，根据表格数据确定，应选106或105倍的稀释比较合适。用稀释涂布平板法统计的细菌数目会比实际数目偏小，其原因是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。