Question

人类胰岛素基因位于第11号染色体上，长度8416bp，包含3个外显子和2个内含子，人类胰岛素的氨基酸序列已知。回答相关问题：

（1）上图是利用PCR技术获取人胰岛素基因的方法，除了此方法外，还可以利用的方法是____________。

 （2）利用PCR技术获取人胰岛素基因，在缓冲液中除了要添加模板和引物外，还需要添加的物质有_____________________________。

（3）经过______轮循环可以得到所需的目的基因，一个DNA分子经过5轮循环，需要引物A_____个，从PCR的过程和DNA分子的特点，试着写出设计引物需要注意的问题_____、_____（答出2点即可）。

（4）利用SDS-凝胶电泳分离不同DNA分子，迁移速度取决于__________________。

（5）利用图示方法获取的目的基因，直接构建基因表达载体后导入大肠杆菌，（选能或不能） ___________表达出人胰岛素，理由是______________________________。

Answer

从基因文库获取或人工合成 四种脱氧核苷酸（dNTP）和热稳定DNA聚合酶（Taq酶） 3 31 引物自身不能有互补序列 引物之间不能有互补序列 DNA分子的大小 不能 因为此方法获得的目的基因中含有内含子，大肠杆菌无法正常识别内含子而对内含子部分转录的mRNA进行翻译，导致合成的蛋白质出现错误

【解析】

根据题干信息和图形分析，基因工程的基本步骤包括目的基因的获取、构建基因表达载体、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与表达；图示目的基因为人类胰岛素基因（位于11号常染色体上），其通过PCR技术进行扩增，需要A、B两种引物；PCR扩增目的基因的过程包括变性、退货、延伸。

（1）获取目的基因的方法除了PCR技术，还有从基因文库获取或人工合成。

（2）用PCR技术扩增目的基因（人胰岛素基因）时，所需的条件有引物、模板 (目的基因或人胰岛素基因)、原料(4种脱氧核糖核苷酸)和热稳定DNA聚合酶（Taq酶）等。

（3）根据PCR过程和DNA分子半保留复制特点可知，前两轮循环产生的四个DNA分子的两条链均不等长，第三轮循环产生的DNA分子存在等长的两条核苷酸链，即仅含引物之间的序列，因此，经过三轮循环可以得到所需的目的基因；一个DNA分子经过5轮循环，理论上至少需要26-2=62个引物，其中A引物31个。引物设计时需要注意以下几点：引物自身不能有互补序列；引物之间不能有互补序列；引物长度适当；引物能与目的基因两侧特异性结合；避免与扩增DNA内有过多互补的序列。

（4）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术中分子的迁移速率主要取决于分子的大小，因此利用SDS-凝胶电泳分离不同DNA分子，迁移速度取决于DNA分子的大小。

（5）题干信息显示，图示获取的目的基因含有外显子和内含子，因此直接将含有此目的基因的表达载体导入大肠杆菌并不能表达出胰岛素，原因是大肠杆菌无法正常识别内含子而对内含子部分转录的mRNA进行翻译，导致合成的蛋白质出现错误。