Question

回答下列（一）、（二）小题：

（一）平板浇注法是常用的菌种分离纯化方法，是将待分离的样品用无菌水作梯度系列稀释后，取合适稀释度的少量菌悬液加至无菌培养皿中，立即倒入融化的固体培养基，经充分混匀后，置室温下培养。下图是研究人员用平板浇注法从土壤样品中分离以工业废甲醇为碳源的酵母菌，并进行大量培养的操作流程，请回答下列问题：

（1）为分离培养该酵母菌，配制培养基时应以___________为唯一碳源，按照培养基配方准确称量各组分，将其溶解、定容后，调节培养基的pH，及时对培养基进行分装，并进行_____________灭菌。

（2）取步骤②中不同梯度的稀释液加入标记好的无菌培养皿中，在步骤③中将温度约__________（在25℃、50℃或80℃（3个中选择）的培养基倒入培养皿混匀，冷凝后倒置培养。经培养，可在培养基的 _____________部位出现许多单菌落。

（3）挑取平板中长出的单菌落，按步骤④所示进行划线分离。下列叙述不合理的是_______。

A．为保证无菌操作，接种环使用前必须进行灼烧灭菌

B．划线时应避免划破培养基表面，以免不能形成正常菌落

C．挑取菌落时，应挑取多个菌落，分别测定酵母细胞中甲醇的含量

D．可以通过逐步提高培养基中甲醇的浓度，获得甲醇高耐受株

（4）步骤⑤中，为使酵母数量迅速增加，培养过程中需保证充足的营养和____________供应。为监测酵母的细胞密度，将发酵液稀释1000倍后，用25×16（2mm×2mm×0．lmm）型血细胞计数板计数5个中格中的细胞数，细胞的个数应不少于_____________，才能达到每毫升至少含2×10⁹个细胞的预期密度。

（二）回答与基因工程及其应用有关的问题：

（1）博耶（H．Boyer）和科恩（S．Coben）将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达，该研究除证明了质粒可以作为载体外，还证明了_____________________（答出两点即可）。

（2）体外重组的质粒可通过Ca²⁺参与的方法导入大肠杆菌细胞；而体外重组的噬菌体DNA通常需与_________组装成完整噬菌体后，才能通过侵染的方法将重组的噬菌体DNA导入宿主细胞，在细菌、心肌细胞、叶肉细胞中，可作为重组噬菌体宿主细胞的是___________。

（3）真核生物基因（目的基因）在大肠杆菌细胞内表达时，产生出的蛋白质可能会被降解。为防止大肠杆菌内的蛋白质被降解，在实验中应选用___________的大肠杆菌作为受体细胞。在提取纯化蛋白质的过程中应添加________，防止目的蛋白质被降解。

Answer

甲醇 高压蒸汽 50℃ 表层和内部 C 氧气 160 体外重组的质粒可以进入受体细胞；真核生物基因可在原核细胞中表达 外壳蛋白（或答噬菌体蛋白） 细菌 蛋白酶缺陷型 蛋白酶

【解析】

1、稀释涂布平板法在培养基上分离、培养出微生物的单个菌落，以便于计数、移植、分离，从而达到纯化培养的目的。

2、选择培养基是在培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物的生长，促进所需要的微生物的生长。从土壤样品中分离以工业废甲醇为碳源的酵母菌，那么培养基中要加入甲醇，且是唯一碳源。

3、据图分析，①称量土样，里面含有需要分离的酵母菌；②表示梯度稀释，③④表示平板划线法，进行纯化培养；⑤表示扩大培养，获得更多的酵母菌。

4、基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因—DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA—分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质—抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。

（一）（1）要想从土壤样品中分离以工业废甲醇为碳源的酵母菌，配制培养基时应以甲醇为唯一碳源，按照培养基配方准确称量各组分，将其溶解、定容后，调节培养基的pH，及时对培养基进行分装，并进行高压蒸汽灭菌。

（2）倒平板时，培养基需要冷却到50℃左右才能用来倒平板，所以在步骤③中应将温度约50℃的培养基倒入培养皿混匀，冷凝后倒置培养。由于酵母菌为兼性厌氧型，所以经培养，可在培养基的表层和内部部位出现单菌落。

（3）A、接种针、接种环使用前都必须灭菌，做到无菌操作，A正确；

B、划线时应避免划破培养基表面，否则大量酵母菌聚集，不能形成正常菌落，B正确；

C、挑取菌落时，应挑取多个菌落，分别测定培养液中甲醇的含量，C错误；

D、可以通过逐步提高培养基中甲醇的浓度，获得甲醇高耐受株，D正确。

故选C。

（4）有氧呼吸能为酵母菌的繁殖提供大量能量，所以步骤⑤中，为使酵母数量迅速增加，培养过程中需保证充足的营养和氧气供应，以促进有氧呼吸，进而大量繁殖。假设理论上5个中方格的活细胞数不应少于n才能达到每毫升2×109个活细胞的预期密度，根据“将发酵液稀释1000倍后，用25×16（2mm×2mm×0．lmm）型血细胞计数板计数”，可列式为25÷5×n÷0.4×1000×1000=2×109，解得n=160，所以5个中方格中酵母菌数不少于160。

（二）（1）将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达，说明体外重组的质粒可以进入受体细胞；也可说明真核生物基因可在原核细胞中表达。

（2）噬菌体为DNA病毒，由DNA和蛋白质组成，所以体外重组的噬菌体DNA通常需与蛋白质外壳组装才能形成完整噬菌体。噬菌体属于细菌病毒，宿主细胞只能是细菌，所以在细菌、心肌细胞、叶肉细胞中，可作为重组噬菌体宿主细胞的是细菌。

（3）真核生物基因（目的基因）在大肠杆菌细胞内表达时，表达出的蛋白质可能会被降解，为防止蛋白质被降解，选择的大肠杆菌体内应该没有可以降解蛋白质的酶，所以选择蛋白酶缺陷型的大肠杆菌作为受体细胞，在蛋白质纯化的过程中应添加蛋白酶的抑制剂。