Question

近年来，在处理富营养化水体的污水过程中，与化学、物理除氮方法比较，目前认为微生物反硝化去除氮素污染更为经济有效。科研工作者采用基因工程技术构建具有定向高效降解含氮化合物能力的工程菌，进行了相关研究。请回答问题。

（1）微生物的反硝化作用，是氮循环中一个重要的生物过程。亚硝酸盐还原酶（Nir）是该过程的关键酶，是由野生菌株YP4的反硝化基因（nirS）转录后，再翻译出具有___________作用的蛋白质。

（2）工程菌的构建

①研究者利用NCBI数据库查到nirS基因的碱基序列，设计引物，利用PCR技术扩增nirS基因。PCR技术利用了___________的原理，使用耐高温Taq酶而未使用普通DNA聚合酶的主要原因是______________________。

②研究者用HindⅢ和BamHI两种限制酶处理nirS基因与p质粒，在_______________酶的作用下进行体外连接，用连接产物转化大肠杆菌DH5，在含庆大霉素的培养基中进行培养并提取质粒，如果用HindⅢ和BamHI双酶切，得到两个片断电泳结果分别与_______________电泳结果基本一致，说明获得重组质粒pYP4S。

③将pYP4S转化到野生菌株YP4中形成工程菌YP4S，培养后进行PCR鉴定。为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。图1所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的最佳一对引物组合是_________。某学生错选了图中的另外一对引物组合，扩增出长度为2．1kb的片段，原因是_______________。

（3）检测工程菌YP4S除氮的效能

①工程菌株YP4S在已灭菌的模拟污水中培养36h后，检测结果如图2。结果表明___________________。

②要进一步证明工程菌对含氮污水治理更有效，应___________________________。

Answer

催化 DNA复制 PCR过程中DNA在高温下解链，这样的高温下，普通的DNA聚合酶的生物活性丧失 DNA连接 p质粒和插入片段（目的基因） 乙和丙 目的基因反向连接 工程菌株除氮效果优于野生菌 Ⅰ．工程菌YP4S与野生菌分别处理实际污水36hⅡ．检测除氮率

【解析】

分析题干可知：目前认为微生物反硝化去除氮素污染更为经济有效，科研工作者采用基因工程技术构建具有定向高效降解含氮化合物能力的工程菌，故需依据基因工程的相关原理进行分析作答。

（1）亚硝酸盐还原酶（Nir）是该过程的关键酶，酶是经基因的转录和翻译过程形成的有催化作用的蛋白质。

（2）①PCR技术依据的原理是DNA分子的复制；因PCR过程中DNA解旋是在在高温下进行的（90-95℃），这样的高温下，普通的DNA聚合酶的生物活性丧失，故在PCR技术中应采用使用耐高温的Taq酶。

②连接两个DNA片段所用的酶是DNA连接酶；因实验中nirS基因与p质粒是分别用HindⅢ和BamHI两种限制酶处理的，故若再用HindⅢ和BamHI双酶切之后，得到两个片断电泳结果分别与p质粒和插入片段（nirS基因）电泳结果基本一致，可说明获得重组质粒pYP4S。

③PCR技术要求两种引物分别和目的基因的两条单链结合，沿相反方向合成子链，结合目的基因的插入位置可知，PCR鉴定时应选择的最佳一对引物组合是乙和丙；若某学生错选了图中的另外一对引物组合（甲和乙），只有反向连接后才能扩增出长度为2．1kb的片段 （2＋0.1kb）。

（3）①图2结果表明，无论是总氮还是NH4＋、NO3—的去除率，工程菌株除氮效果优于野生菌。

②因图2是工程菌株YP4S在已灭菌的模拟污水中的处理结果，故要进一步证明工程菌对含氮污水治理更有效，应用工程菌YP4S与野生菌分别处理实际污水36h，检测除氮率。