Question

回答下列（一）（二）小题

（一）请回答从土壤中分离产脲酶细菌和脲酶固定化实验的有关问题

（1）LB固体培养基：取适量的蛋白胨、酵母提取物、NaCl，加入一定量的蒸馏水溶解，再加 _______ ，__________灭菌备用。

（2）尿素固体培养基：先将适宜浓度的尿素溶液用灭菌过的 _______过滤，然后将尿素溶液加入到已经灭菌的含有_____ 的培养基中，备用。

（3）取适量含产脲酶细菌的10^-4、10^-5两种土壤稀释液，分别涂布接种到LB固体培养基和尿素固体培养基上，培养48h，推测固体培养基上生长的菌落数最少的是_____（A． 10^-5稀释液+尿素固体培养基   B． 10^-5稀释液+LB固体培养基  C． 10^-4稀释液+尿素固体培养基  ）。在尿素固体培养基上产脲酶细菌菌落周围出现__________ 。

（4）制备固定化脲酶时，用石英砂吸附脲酶，装柱。再用蒸馏水洗涤固定化酶柱，其作用是 _____________。

（二）某小组欲进行烟草原生质体分离与培养的研究。请回答：

（1）原生质体的分离：在无菌条件下，取烟草无菌苗的叶片，放入含有0．5mol/L甘露醇（维持较高_________）的混合液处理，经过离心纯化后获得原生质体。

（2）原生质体的培养：将原生质体进行培养，重新长出细胞壁，形成______ 。此时，应该降低培养基中甘露醇浓度，以利于胚性细胞继续培养形成细胞团，然后经两条途径形成再生植株。途径一：细胞团经球形胚、______和胚状体，最后发育成植株。途径二：细胞团增殖为愈伤组织，然后在发芽培养基上诱导出芽，从状芽经过生根后形成完整植株。上述发芽培养基中含量相对较高的激素是___________ ，胚性细胞的主要特点是：________。

（A．液泡小、细胞核小  B．液泡大，细胞核大  C．液泡大，细胞核小  D．液泡小、细胞核大）

（3）为了对烟草的某些性状进行改良，分离的到两种烟草的原生质体后，通过________方法将他们的遗传物质组合在一起，经培养获得具有新性状的再生植株。提取再生植株的DNA，采用__________扩增相关基因，来鉴定遗传物质是否成功重组。

Answer

琼脂 高压蒸汽 G6玻璃砂漏斗 酚红 A 红色环 除去游离的脲酶 渗透压 胚性细胞 心形胚 细胞分裂素 D 原生质体融合 PCR

【解析】

微生物的实验室培养，常用到培养基，培养基，是指供给微生物、植物或动物（或组织）生长繁殖的，由不同营养物质组合配制而成的营养基质。一般都含有碳水化合物、含氮物质、无机盐（包括微量元素）、维生素和水等几大类物质。培养基既是提供细胞营养和促使细胞增殖的基础物质，也是细胞生长和繁殖的生存环境。培养基种类很多，培养基按物理状态分为固体培养基、液体培养基和半固体培养基，固体培养基通常需要加入琼脂凝固；根据培养功能可分为基础培养基、选择培养基、加富培养基、鉴别培养基等。培养基配成后一般需测试并调节pH，还需进行灭菌，通常有高温灭菌和过滤灭菌。植物克隆的技术基础是植物组织培养，植物细胞工程的原理是植物细胞全能性。

（一）（1）固体培养基需要加琼脂凝固。培养基配制完成后要经高压蒸汽灭菌备用。

（2）尿素高温易分解，不能用高压蒸汽灭菌锅灭菌，尿素溶液用灭菌过的G6玻璃砂漏斗过滤。尿素被细菌分解形成碱性物质氨，在碱性环境下，酚红指示剂变红。

（3）LB固体培养基含有的营养全面，培养基上会有较多菌落，尿素培养基只以尿素为唯一碳源，培养基上有较少菌落，再对比A和C的浓度，A的稀释度为10-5，浓度低，因此固体培养基上生长的菌落数最少的是A。尿素培养基上细菌产生的脲酶将尿素分解为NH3，使菌落周围出现红色环。

（4）用蒸馏水洗涤固定化酶柱，可以除去游离的脲酶（未吸附）。

（二）（1）为了防止原生质体吸水胀破，因此使用高浓度的甘露醇，维持较高的渗透压。

（2）将原生质体进行培养，重新长出细胞壁，这样的细胞称为胚性细胞。途径一：胚胎发生途径，即细胞团经球形胚、心形胚和胚状体，最后发育成植株。途径二：器官发生途径，即细胞团增殖为愈伤组织，然后在发芽培养基上诱导出芽，从状芽经过生根后形成完整植株。细胞分裂素促进细胞分裂，促进萌发，发芽培养基中细胞分裂素含量相对较高。胚性细胞全能性大，细胞分裂能力强，液泡小、细胞核大。

（3）不同细胞的原生质体通过人工方法诱导融合，然后进行离体培养，使其再生杂种植株的技术称为原生质体融合，可以将不同细胞的遗传物质组合在一起。经培养获得具有新性状的再生植株。PCR是体外扩增DNA的常用方法。