Question

Ⅰ．回答下列制作澄清果汁的相关问题：

（1）壳聚糖本身是一种多孔网状天然高分子颗粒材料，对蛋白质有显著的亲合力，可将果胶酶通过吸附-交联法固定在壳聚糖载体上，再将固定化酶的载体装到反应柱中（见下图）。固定化酶的好处有________________________、________________________；但固定化酶的活性与未固定前相比较，其活性可能不变，也可能会发生________________________。

（2）壳聚糖一般先进行________________________处理，然后再与果胶酶混合，使其能固定化更多的果胶酶。固定化酶柱应先倒入一定量的蒸馏水，洗掉________________________，然后再倒入浑浊的果汁。

（3）果胶是植物细胞壁以及________________________的主要组成成分，浑浊的果汁在反应柱中从上部流到下部的过程中果胶最终被彻底水解成可溶性的________________________，从而使流出的果汁变的澄清。若以透光率作为实验指标，可变因素是浑浊果汁从上部流到下部的时间，则实验结果最可能为________________________。

Ⅱ．抗生素滥用导致耐药性目前已成为一个严重的公共健康问题，近年来，“超级细菌”等事件的发生更显示出这一问题的严重性。抗菌肽（AMPs）是一类具有广谱抗菌性，而且其不易产生耐药性。为了改善抗菌肽的抗菌功能，常利用基因工程技术使抗菌肽在不同来源的宿主细胞内进行蛋白的重组表达。β-防御素是一种抗菌肽。构建β-防御素（β-defensin130）表达载体在大肠杆菌中表达。结合已知条件回答下列问题：

如图为表达载体（PET-28a）和含有目的基因β-防御素（defensin130）的片段。（说明：Kan^r和Amp^r分别表示卡那霉素和氨苄青霉素抗性基因；promoter表示基因的启动部位）

（1）获得含有目的基因的重组DNA分子，需用________________________和________________________两种酶分别切割表达载体和含有目的基因的片段，并用________________________酶将它们连接。

（2）把构建好的重组DNA分子导入到受体细胞，用适宜浓度的氯化钙处理受体细胞增加细胞壁的通透性的目的是________________________。3×β-defensin130

（3）筛选含有目的基因β-防御素（β-defensin130）的受体细胞，先将菌液涂布在含有________________________（抗生素）的培养基中培养，然后将所有菌落转移至含有________________________（抗生素）的培养基中培养，最后挑选出目的菌落。

（4）在无菌操作下将目的单菌落用接种环取出，再用划线法接种在斜面培养基上，37°C培养24小时后，置于________________________中保存。

（5）若受体细胞为双子叶植物，常用________________________法将目的基因导入植物体细胞，再将体细胞进行组织培养，得到转基因植物。

Answer

酶的稳定性好（酶可以反复利用） 酶与底物和产物易分开 下降或上升 研磨 未吸附的果胶酶 胞间（质）层 半乳糖醛酸 果汁透光率先变大，然后稳定不变 EcoRI XhoI DNA连接酶 增加转化的成功率 Kan Amp 4°C冰箱 农杆菌转化

【解析】

Ⅰ．本题主要考查固化酶和果胶酶的相关知识。果胶物质主要存在于植物初生壁和细胞中间，果胶物质是细胞壁的基质多糖。果胶酶本质上是聚半乳糖醛酸水解酶，果胶酶水解果胶主要生成β-半乳糖醛酸。

Ⅱ．本题考基因工程的应用和菌种的保存，意在考查考生的识图能力和对所学知识的理解能力。

Ⅰ．（1）固定化酶的优点有：不溶于水，易于与底物、产物分离；稳定性好；可反复使用；可连续化生产，但固定化酶的活性与未固定时相比较，其活性可能不变，也可能由于固定介质的影响而发生下降或上升的变化。
（2）固定化酶过程中，壳聚糖一般先进行研磨，提高壳聚糖表面粗糙度处理以增大固定化酶的接触面积，然后再与果胶酶混合，以固定化更多的果胶酶。固定化酶柱应先倒入一定量的蒸馏水洗掉未被固定的酶等，然后再倒入浑浊的果汁。
（3）果胶是植物细胞壁以及胞间层的主要组成成分之一。果胶酶能使榨取果汁更容易，也使得浑浊的果汁变得澄清。浑浊的果汁在反应柱中从上部流到下部的过程中果胶被分解成可溶性的半乳糖醛酸，从而使流出来的果汁变得澄清。若以透光率作为实验指标，可变因素是浑浊果汁从上部流到下部的时间，则实验结果最可能为半乳糖醛酸果汁透光率先变大，然后稳定不变。

Ⅱ．（1）根据图示中目的基因两端限制酶的酶切位点以及质粒上限制酶的酶切位点可知获得含有目的基因的重组DNA分子，需用EcoRI和XhoI两种酶分别切割表达载体和含有目的基因的片段，以保证载体和目的基因能形成相同的黏性末端，并用DNA连接酶将它们连接。

（2）把构建好的重组DNA分子导入到受体细胞，用适宜浓度的氯化钙处理受体细胞增加细胞壁的通透性，目的是使受体细胞成为感受态，使表达载体容易进入受体细胞，以增加转化的成功率。

（3）筛选含有目的基因β-防御素（β-defensin130）的受体细胞，先将菌液涂布在含有Kan的培养基中培养，然后将所有菌转移至含有Amp的培养基中培养，最后挑选出目的菌落。

（4）菌种的临时保藏需在无菌操作下将目的单菌落用接种环取出，再用划线法接种在斜面上，37°C培养24小时后，置于4℃冰箱中保存。

（5）农杆菌在自然条件下可感染双子叶植物和裸子植物，所以若受体细胞为双子叶植物，常用农杆菌转化法将目的基因导入植物体细胞，再将体细胞进行组织培养，得到转基因植物。