Question

回答下列有关分离土壤中以尿素为氮源的微生物的实验：

（1）取 1 g 土样后用_______________逐步稀释，得到不同浓度的稀释液，取样时尽量只取 _________________ 。

（2）尿素溶液用______________________ （填工具）进行灭菌，下列关于该灭菌操作的叙述错误的是（______）

A．固定化酶的灭菌可使用该法

B．该工具灭菌后需用盐酸抽滤后直接干燥保存

C．其他培养基成分应用高压蒸汽灭菌法灭菌

D．菌液稀释、接种等均应在酒精灯火焰旁操作

（3）在合适的稀释倍数下，培养基中的红色透明圈直径大小不一，说明不同菌落的微生物可能是同一种菌的不同 ______________   ，这种用于筛选高表达量微生物的方法称为____________。

（4）若在 10^-5 浓度下培养皿的平均菌落数为 13，则该 1g 土样中含分解尿素微生物的数量约为__________个。

Answer

无菌水 悬液 G6玻璃砂漏斗 B 菌株 菌株 1.3x107个

【解析】

分离分解尿素微生物的操作步骤

1.在60℃左右时，将两只三角瓶中已灭菌的LB固体培养基和尿素固体培养基，在酒精灯旁分别倒入两个培养皿中，在水平的超净台上摇匀，平放至凝固。.

2.制备细菌悬液在无菌条件下，将1g土样加到有99mL无菌水的三角瓶中，振荡10min，即成10-2土壤稀释液。依此法制备10-3 、10-4 和10-5土壤稀释液。取样时，尽量只取悬液，播匀，放在试管架上。

3.用涂布分离法分离细菌。取10-4和10-5的土壤稀释液各0.1Ml，分别加到有LB培养基和尿素培养基的培养血中，再将保存在70%酒精中的玻璃刮刀放在酒精灯火焰上,待刮刀上火焰熄灭，在酒精灯火焰旁打开培养叫，将菌液涂布到整个平面上。

4.将培养皿倒置，在37℃恒温箱中培养24~48h。观察菌落数。

5.观察。全营养培养基中有较多的菌落，而尿素为氮源的培养基平板中只有少量菌落。

（1）取1g土样后用无菌水逐步稀释，避免用于稀释的水带入更多杂菌影响土样；得到不同浓度的稀释液，取样时尽量只取悬液，避免所取样品不含或只含少量微生物。

（2）由于尿素加热会分解，无法采用高温灭菌。玻璃砂芯漏斗有6种规格，G6是孔径最小的，可以过滤掉细菌，因此尿素溶液用G6玻璃砂漏斗进行灭菌。

A、酶在高温环境下易失活，同样不能使用高温灭菌，可使用对酶活性无影响的G6玻璃砂漏斗进行灭菌，A正确；

B、砂芯漏斗使用后应用洗涤液进行抽滤，然后放入洗涤液中浸泡48小时，取出用蒸馏水冲洗抽滤烘干保存，B错误；

C、其他培养基成分不会受高温环境影响，高压蒸汽灭菌法可有效除去各种杂菌，因此其他培养基成分应使用高压蒸汽灭菌法，C正确；

D、为避免空气中的杂菌污染菌液，菌液稀释、接种时应在酒精灯火焰旁操作，酒精灯火焰可为其周围提供无菌环境，D正确。

故选B。

（3）培养基中的红色透明圈直径大小不一，说明不同菌落的微生物可能是同一种菌的不同菌株，这种用于筛选高表达量微生物的方法称为菌株。

（4）由于涂布是用的菌液的体积为0.1mL，该1g土样中含分解尿素微生物的数量约为13÷0.1×105=1.3x107个。