Question

（一）图（a）中的三个 DNA 片段上依次表示出了 EcoRI、BamHI 和 Sau3AI 三种限制性内切酶的识别序列与切割位点，图（b）为某种表达载体的示意图（载体上的 EcoRI、Sau3AI 的切点是唯一的）

根据基因工程的有关知识，回答下列问题：

（1）经 BamHI 酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被 _______________酶切后的产物连接。

（2）若某人利用图（b）所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组质粒，如图（c）所示。这三种重组质粒中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有_______________。不能表达的原因是___________。

（3） DNA 连接酶是将两个 DNA 片段连接起来的酶，它作用对象是 ________键。

（二）丝素蛋白是家蚕的一种分泌性复合蛋白，由丝素蛋白重链（FibH）、丝素蛋白轻链（Fibl）和 P25 糖蛋白组成。将 Fibl 基因导入大肠杆菌（不含质粒 A）并实现表达的过程如图所示。

①构建重组质粒时要用到的工具酶是________________。

②接种在含氨苄青霉素培养基上的大肠杆菌，有的不能形成菌落，原因是____________。

③影印接种就是用丝绒做成与平板大小相近的印章，然后把长有菌落的母平板倒置在丝绒印章上，轻   轻印一下，再把此印章在新的培养基平板上轻轻印一下。经培养后，比较新平板上长出的菌落与母平板上的菌落位置，推测可能导入了重组质粒的菌落是 ____________（用字母表示）。

④目的基因成功表达的标志是_______________。

Answer

Sau3A I 甲、丙 甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，两者目的基因均不能转录，所以都不能表达目的基因的产物。 磷酸二酯键 限制酶和DNA连接酶 没有导入质粒 b、c 大肠杆菌合成丝素蛋白轻链

【解析】

1．基因工程技术的基本步骤：

（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成．

（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等．

（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法．

（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术．个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等．

2．基因工程的工具：

（1）限制酶：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。

（2）DNA连接酶：连接的是两个核苷酸之间的磷酸二酯键。

（3）运载体：常用的运载体：质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒。

3.DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核酸片段的3′末端的羟基上，形成磷酸二酯键；而DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，不是在单个核苷酸与DNA片段之间形成磷酸二酯键。DNA聚合酶是以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键形成一条与模板链互补的DNA链。

（一）（1） 由于限制酶Sau3A I与BamHI切割后产生的片段具有相同的黏性末端，所以经BamHI酶切割得到的目的基因可以与上述表达载体被Sau3A I酶切后的产物连接。

（2）启动子是一段有特殊序列的DNA片段，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质。终止子也是一段有特殊结构的DNA短片段，相当于一盏红色信号灯， 使转录在所需要的地方停止下来。在基因表达载体中，启动子应位于目的基因的首端，终止子应位于目的基因的尾端，这样目的基因才能表达。而甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，两者目的基因均不能转录，所以都不能表达目的基因的产物。

（3）DNA 连接酶能催化两个 DNA 片段之间的磷酸二酯键形成。

（二）①构建重组质粒需要限制酶和DNA连接酶。

②接种在含氨苄青霉素培养基上的大肠杆菌，有的不能形成菌落，说明对氨苄青霉素不具有抗性，而导入成功的大肠杆菌都表现出对氨苄青霉素的抗性，故大肠杆菌不能长出菌落的原因是因为没有导入质粒。

③由图可知，a、b、c、d都是对氨苄青霉素有抗性的大肠杆菌，说明都是成功导入质粒的大肠杆菌，图中显示重组质粒中的四环素抗性基因被破坏，故导入重组质粒的大肠杆菌不具有对四环素的抗性，故在含有四环素培养基上生长的菌落是导入质粒A的大肠杆菌，即图中的a、d，b、c菌落没有长出，说明这两个菌落不具有对四环素的抗性，故b、c可能是导入重组质粒的大肠杆菌。

④题中的目的基因是Fibl 基因，而目的基因表达成功的含义是控制形成了相应的蛋白质，故本题中目的基因成功表达的标志是大肠杆菌合成丝素蛋白轻链。