Question

正常细胞不能合成干扰素，但含有干扰素基因。我国科学家釆用基因工程技术生产干扰素a-2b已实现量产。具体做法是将产生干扰素的人白细胞的mRNA分离，反转录得到干扰素基因。将含有四环素、氨苄青霉素抗性基因的质粒PBR322和干扰素基因进行双酶切，用连接酶连接。将重组载体DNA分子在一定条件下导入大肠杆菌，在培养基中筛选培养，检测干扰素的表达量，选出高效表达的工程菌。请回答：

（1）在分化诱导因子作用下，正常细胞可以摆脱抑制、合成干扰素，该过程发生的实质是________________________________

（2）据下图分析，构建重组载体DNA分子时，可以选用_____两种限制酶对质粒pBR322和干扰素基因进行双酶切，目的是既能保证目的基因和质粒正向连接，又能防止_____________________________(答两点)。

（3）将重组质粒导入大肠杆菌中，然后将细菌涂布到含_____的选择培养基上培养，就可得到含质粒PBR322或重组质粒的细菌单菌落；再从每一个单菌落中挑取部分细菌转涂到含有_____的培养基上，不能生长的绝大部分是含有重组质粒的细菌，原因是_____

（4）干扰素在体外保存非常困难，如果将其分子中的一个半胱氨酸变成丝氨酸，在-70°C 条件下可以保存半年。实现这一转变需要直接对_____进行修饰或改造，这属于蛋白质工程的范畴。

Answer

基因的选择性表达 酶B、酶C 质粒与目的基因自身环化；防止同时破坏质粒中的两个标记基因 氨苄青霉素 四环素 目的基因的插入破坏了四环素抗性基因，重组质粒上只含有氨苄青霉素抗性基因，而质粒上含氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因，在含有四环素的培养基上，导入重组质粒的细菌不能生长，而只导入质粒的细菌能生长 基因

【解析】

1、基因表达载体的组成：目的基因、启动子、终止子、标记基因等。标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选。

2、由于不同限制酶识别的碱基序列不同，所以在切割质粒和目的基因时常用双酶切，可防止目的基因反向粘连和质粒自行环化。

（1）细胞分化的实质是基因选择性表达，故在分化诱导因子作用下，正常细胞可以摆脱抑制、合成干扰素，该过程发生的实质是基因的选择性表达。

（2）标记基因可用于鉴定目的基因是否导入受体细胞，所以重组质粒上至少要保留一个标记基因，由于两个标记基因上均含有酶A的切点，所以不能用酶A切割，为了防止连接时目的基因和质粒自身环化，故在构建重组载体DNA分子时，可以选用酶B和酶C两种限制酶对质粒pBR322和干扰素基因进行双酶切。

（3）由于质粒和重组质粒上都含有氨苄青霉素抗性基因，而未导入质粒的细菌不含有该抗性基因，所以将重组质粒导入大肠杆菌中，然后将细菌涂布到含氨苄青霉素的选择培养基上培养，就可得到含质粒PBR322或重组质粒的细菌单菌落；由于目的基因的插入破坏了四环素抗性基因，重组质粒上只含有氨苄青霉素抗性基因，而质粒上含有氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因，因此再从前面培养基上获得的每一个单菌落中挑取部分细菌转涂到含有四环素的培养基上，不能生长的绝大部分是含有重组质粒的细菌。

（4）蛋白质工程是通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造的一项技术。