Question

如图所示为A、B、C三种质粒和一个含目的基因D的DNA片段示意图。图1中Ap为氨苄青霉素抗性基因，Tc为四环素抗性基因，lacZ为蓝色显色基因。图中EcoRⅠ、PvuⅠ为两种限制酶，质粒上限制酶括号内的数字表示限制酶切割位点与复制原点的距离。回答下列问题：

（1）图中三种质粒中不能作为目的基因运载体的是______，理由是______、______。

（2）在基因工程的操作过程中，需要检查目的基因是否重组到质粒中，应使用______酶切重组质粒，完全酶切后，进行电泳检测。若电泳图谱中出现长度为1.1kb和5.6kb，或者______kb和______kb的片段，则可判断该重组质粒已与目的基因重组成功。

（3）为研究目的基因D的功能，研究人员用图2所示的引物组合分别扩增D基因的D₁片段、D₃片段（DNA复制子链的延伸方向5′→3′）。

注：引物Ⅱ、Ⅲ上的x、y片段分别与N基因两端互补配对

①用引物Ⅰ、Ⅱ组合扩增后，得到的绝大部分DNA片段是图3中的______。

②将大量N基因片段与扩增得到的D₁片段、D₃片段置于PCR反应体系中进行扩增，得到的绝大多数扩增产物是______（填“D₁-N”或“D₁-D₃-N”或“D₃-N”或“D₁-N-D₃”）。

Answer

质粒A、质粒C （质粒A）缺少标记基因 （质粒C）复制原点会被限制酶切割 EcoRⅠ 3.1 3.6 d D1-N-D3

【解析】

本题以图文结合为情境综合考查学生对基因工程的基本操作程序，特别是利用PCR技术扩增目的基因以及基因表达载体的构建等相关知识的识记和理解能力，以及分析问题的能力。

(1)分析图1可知：目的基因D的两端均存在限制酶PvuⅠ的识别位点，而EcoRⅠ的识别位点则在目的基因D的内部，因此在构建重组质粒时，应选用PvuⅠ切割含有目的基因D的DNA片段，以保证目的基因D的结构完整。据此分析A、B、C三种质粒的结构可知：质粒A缺少标记基因，质粒C在用和目的基因相同的限制酶PvuⅠ切割时，复制原点会被限制酶切割，进而影响重组质粒的自主复制，所以质粒A、质粒C均不能作为目的基因的运载体。

(2)依题意和分析图1可知：由于目的基因D的长度为4.0kb，因此用质粒B构建的重组质粒的长度为4.0kb＋2.7kb＝6.7kb。在检查目的基因是否重组到质粒中的操作过程中，重组质粒被某种限制酶完全酶切后，电泳检测的结果出现了1.1kb的片段，说明使用的限制酶不可能是PvuⅠ（用PvuⅠ切割不能得到1.1kb的片段），而是EcoRⅠ。用质粒B构建重组质粒时，若目的基因D正向插入（目的基因D上的EcoRⅠ酶切位点与质粒B上的EcoRⅠ酶切位点的距离最近），则用EcoRⅠ酶切时，会得到0.1＋1.0＝1.1（kb）和（2.7－0.1）＋（4.0－1.0）＝5.6（kb）的两个片段；用质粒B构建重组质粒时，若目的基因D反向插入（目的基因D上的EcoRⅠ酶切位点与质粒B上的EcoRⅠ酶切位点的距离较远），则用EcoRⅠ酶切时，会得到0.1＋3.0＝3.1（kb）和（2.7－0.1）＋（4.0－3.0）＝3.6（kb）的两个片段。

(3) 分析图2可知：①用引物Ⅰ、Ⅱ组合扩增的是D1片段，以引物Ⅱ所在的单链为模板在引物Ⅰ的作用下合成DNA时，引物Ⅱ上的x片段也被作为模板合成子链，因此得到的绝大部分DNA片段是图3中的d。②由于引物Ⅱ、Ⅲ上的x、y片段都能与N基因两条链上的碱基进行互补配对，因此将大量N基因片段与扩增得到的D1片段、D3片段置于PCR反应体系中进行扩增，得到的绝大多数扩增产物是D1-N-D3。