Question

几丁质是构成植物病原真菌和昆虫外骨骼的组分，高等动植物和人类体内不含几丁质。某些微生物能合成几丁质酶（胞外酶），将几丁质降解为N-乙酰氨基葡萄糖。科研人员通过微生物培养获得几丁质酶，用于生物防治。回答下列问题。

（l）几丁质酶用于植物病虫害防治的优势是____。

（2）欲筛选几丁质酶高产菌株，应在培养基中加入几丁质，为微生物提供____。菌株接种前对培养基灭菌，杀死培养基内外 _______。菌株筛选成功后，可将培养的菌液与灭菌后的 ___混合，在-20℃长期保存。

（3）将筛选出的菌株接种到培养基中，30℃恒温振荡培养至几丁质降解完全，得到几丁质酶发酵液，将其离心，保留_________（填“上清液”或“沉淀”），获得粗酶样品；在胶体几丁质固体培养基上打孔，将粗酶样品加入孔内，恒温静置8h，根据透明圈的大小可判____________________。

（4）通过SDS -___ 法进行几丁质酶样品纯度检测，加入SDS的目的是____。

Answer

无毒、无污染 碳源、氮源 所有的微生物，包括芽孢和孢子 甘油 上清液 几丁质酶活力的高低 聚丙烯酰胺凝胶电泳 使蛋白质发生完全变性；消除净电荷对迁移率的影响

【解析】

1、培养基的成分：碳源、氮源、水、无机盐、生长因子等。培养基按照用途可分为选择培养基和鉴定培养基。选择培养基具有能够满足筛选微生物正常生长所需的营养物质或条件，而不利于非筛选微生物的生长。而获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵，因此采用无菌技术避免杂菌的污染，对培养基一般采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌处理，目的是杀伤物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。

2、凝胶色谱法原理：凝胶色谱法是根据相对分子质量的大小来分离蛋白质的有效方法，相对分子质量小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程长，移动的速度慢，相对分子质量大的蛋白质不容易进入凝胶内部的通道，路程短，移动的速度快，因此相对分子质量不同的蛋白质得以分离。

（1）几丁质酶的本质是蛋白质，其作用主要是降解几丁质，而几丁质是构成植物病原真菌和昆虫外骨骼的组分，且高等动植物和人类体内不含几丁质，几丁质酶用于植物病虫害防治的优势是无污染。

（2）培养微生物的培养基必不可少的条件是碳源、氮源、无机盐、水、适宜pH以及温度等。要筛选几丁质酶高产菌株，应在培养基中加入几丁质作为微生物营养来源，几丁质为N-乙酰葡糖胺通过β-1，4-糖苷键连接聚合而成的多糖，为其提供碳源和氮源。微生物的接种过程需要严格无菌操作，防止菌株受到污染，在菌株接种前应对培养基灭菌，杀死培养基内外所有微生物，包括芽孢和孢子。污染菌液的长期保存应隔绝空气，防止受到其他污染，通常在菌株筛选成功后，将培养的菌液与灭菌的甘油混合，在-20℃长期保存。

（3）将几丁质发酵液离心，重的菌株沉淀在底部，而粗酶样品分布于上清液；通过观察固体培养基上是否产生透明圈来确定菌株是否具有降解几丁质的酶活性，而透明圈的大小指几丁质酶活力的高低。

（4）几丁质酶的本质是蛋白质，蛋白质样品纯度检测采用的方法是SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子大小等因素，为了消除净电荷对迁移率的影响，可以在凝胶中加入SDS。