Question

转染是指利用一定手段使外源基因进入细胞中并稳定表达的过程。腺病毒载体常用于外源基因的转染，这在基因治疗、疫苗研发和动物细胞培养的可视化监控方面有着广阔的应用前景。回答下列问题。

（l）腺病毒营____活，用作转染的腺病毒载体上具有____识别和结合的部位，是外源基因在受体细胞中启动表达的关键。

（2）构建腺病毒载体时，先用同种限制酶对腺病毒DNA和外源基因进行切割，可获得相同的____，再用DNA连接酶恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的___。

（3）通过腺病毒载体将蓝色荧光基因转染山羊耳缘成纤维细胞，利用蓝色荧光直观监控细胞的体外培养过程。首先将山羊耳缘组织块用胰蛋白酶或_______处理得到单个成纤维细胞，培养至贴满瓶壁时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为________。这时，重新用胰蛋白酶等处理，然后分瓶继续进行 _______培养。培养时使用的合成培养基，通常需加入 ___等一些天然成分，以满足细胞对营养物质的全面需求。

Answer

寄生 RNA聚合酶 黏性末端或平末端 磷酸二酯键 胶原蛋白酶 细胞的接触抑制 传代 血清、血浆

【解析】

1、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。构建基因表达载体时需要用同种限制酶切割目的基因和载体，以产生相同的末端，然后用DNA连接酶连接，恢复被切开的核苷酸之间的磷酸二酯键，RNA聚合酶能够与启动子识别并结合催化转录的进行，这是是外源基因在受体细胞中启动表达的关键。

2、动物细胞培养的流程：取动物组织块（动物胚胎或幼龄动物的器官或组织）→剪碎→用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞→制成细胞悬液→转入培养瓶中进行原代培养→贴满瓶壁的细胞重新用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞继续传代培养。

（1）腺病毒属于动物病毒，其无细胞结构，营寄生生活，必须寄生于宿主的活细胞中才能繁殖；用作转染的腺病毒载体上应具有RNA聚合酶识别和结合的部位启动子，这样才能驱动目的基因转录形成mRNA，最终合成相应的蛋白质。

（2）构建腺病毒载体时，先用同种限制酶对腺病毒DNA和外源基因进行切割，可以获得相同的黏性末端或平末端，再用DNA连接酶恢复被限制酶切开的两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键。

（3）对山羊耳缘组织块用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理得到单个成纤维细胞，便于细胞与培养液充分接触；培养至贴满瓶壁时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为接触抑制；这时重新用胰蛋白酶等处理，然后分瓶继续进行传代培养；由于人们对动物细胞培养所需的营养物质还没有完全搞清楚，因此培养时使用的合成培养基，通常需加入血浆、血清等一些天然成分，以满足细胞对营养物质的全面要求。