Question

酿酒酵母不能利用木糖制约了利用植物原料生产乙醇的经济效益。木酮糖激酶是木糖转化、利用的关键 酶，为提高酵母细胞中木酮糖激酶的表达量，科研人员将两种启动子与木酮糖激酶基因结合并导入酿酒酵母细胞，构建 能同时利用葡萄糖和木糖的重组酿酒酵母。下图表示相关研究过程，表是几种限制性内切酶的识别序列及切割位 点。请回答：

 

（1）重组质粒中终止子的作用是 ____________________。表中切割 DNA 后形成相同黏性末端的限制性内切酶是__________________，黏性末端为___________ 。   

（2）过程③使用的限制性内切酶是  _________________。过程⑤需先用 LiAc 处理酿酒酵母细胞，其目的是 _________________________________ ，使细胞处于能吸收环境中DNA的状态。

（3）结合图示分析，进行工程菌筛选时，在含四环素的培养基上长出的菌落不一定是导入重组质粒的酿酒酵母，这是因为 _____________________________________ 。

（4）研究人员对筛选得到的两种重组酵母(甲中导入启动子 A，乙中导入启动子 B)细胞中木酮糖激酶活力及发酵乙醇得率进行比较(发酵条件：1 L 15 g·L^－1 的葡萄糖和 50 g·L^－1 的木糖培养基中，120 h)结果如下表。

重组酿酒酵母	木酮糖激酶酶活力U． mg^-2	葡萄糖消耗量g．L^-1	木糖消耗量g． L^-I	乙醇得率g/g
重组酿酒酵母甲	0． 24	14． 59	48．61	0．34
重组酿酒酵母乙	0． 56	14．98	49．39	0．39

从木酮糖激酶酶活力分析，可以得出的结论是启动子 A 的功能比启动子B____，但本实验中乙醇得率相差不大，其可能的原因是____。

Answer

使转录终止（或使RNA聚合酶与模板分离） XhoⅠ与SalⅠ -AGCT（或TCGA-） EcoRⅠ、BamHⅠ 增大酵母细胞的通透性 普通质粒上有抗四环素基因，导入普通质粒的酵母也能在含四环素的培养基上生长繁殖 弱 实验中发酵时间过长（或培养基中的葡萄糖和木糖含量过少）

【解析】

基因工程技术的基本步骤：

（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。

（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。

（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。

（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。

（1）重组质粒中终止子的作用是使转录终止；根据表中6种限制酶的识别序列及切割位点可知，它们形成的黏性末端依次是-AATT、-GATC、-AGCT、-TCGA、-TA、-TCGA，因此切割DNA后形成相同黏性末端的限制性内切酶是XhoⅠ与SalⅠ，黏性末端为-AGCT（或TCGA-）。

（2）过程①构建的重组DNA的两端含有限制酶EcoRⅠ、BamHⅠ的识别序列，因此过程③使用的限制性内切酶也是EcoRⅠ、BamHⅠ；过程⑤需先用LiAc处理酿酒酵母细胞，其目的是增大酵母细胞的通透性，使细胞处于能吸收环境中DNA的状态。

（3）由于普通质粒上有抗四环素基因，导入普通质粒的酵母也能在含四环素的培养基上生长繁殖，因此进行工程菌筛选时，在含四环素的培养基上长出的菌落不一定是导入重组质粒的酿酒酵母。

（4）甲中导入启动子A，乙中导入启动子B，甲中木糖消耗量小于乙，说明启动子A的功能比启动子B弱，但本实验中乙醇得率相差不大，其可能的原因是实验中发酵时间过长（或培养基中的葡萄糖和木糖含量过少）。