Question

回答下列（一）、（二）小题：

乳糖酶催化乳糖水解，能用于治疗人类的乳糖不耐症，乳糖酶可来自多种酵母菌菌株，现要开展高产乳糖酶酵母菌的筛选、酶的固定化及其特性的研究。请回答：

（1）目标菌株的筛选。已知X-gal在乳糖酶的催化下会产生蓝色产物，将初步筛选得到的菌株在液体培养基中进行______________________，稀释后涂布接种到以______________________为唯一碳源、表面均匀涂有X-gal的固体培养基上，最后应挑选______________________较大的单菌落作为目标菌株。

（2）酶的分离纯化。若某高产菌株合成的乳糖酶大部分分泌到菌体外，则可取适宜培养菌液经离心处理，取______________________进行酶的分离纯化；若高产菌株合成的乳糖酶不分泌到菌体外，需先经过______________________处理后，再进行上述处理。

（3）酶的固定化。磁性壳聚糖微球是一种新型高分子材料，它表面的氨基可以与蛋白质分子的羧基反应生成肽键，固定后的酶并未形成网状结构，这一固定方法为______________________法；与教材中α-淀粉酶的固定方法相比，用此法固定的主要优点和缺点分别是______________________、___________________。

（二）研制针对新冠病毒的单克隆抗体为抗击新冠肺炎疫情的重要途径。N蛋白是新冠病毒的核心蛋白之一，下图表示研制针对N蛋白的单克隆抗体的基本过程，①-⑦表示相关过程。请回答：

（1）N蛋白基因是利用______________法得到的，利用基因工程生产N蛋白的核心步骤是图中的过程______________（用数字序号回答）；过程③常用CaCl₂溶液处理的目的是增大大肠杆菌______________的通透性，上述制备过程要选用大肠杆菌作为受体细胞而不用酵母菌的主要原因是因为酵母菌____________________________。

（2）过程⑤的目的是刺激小鼠并在体内产生更多的______________细胞，过程⑥需要经过诱导融合、多次筛选，以及______________，产生符合要求的杂交瘤细胞株。

（3）在抗疫初期，新闻里看到很多康复者在捐献血浆，用于治疗其他病人，但这种血浆疗法不适宜推广应用，其原因除了捐献者的人数和血浆数量有限外，结合单克隆抗体的优点，还有______________、______________（至少写两个方面）。

Answer

扩大培养 乳糖 蓝色透明圈（或蓝色透明圈直径与菌落直径比值） 上清液 细胞破碎 共价偶联 与酶的结合较牢固，不易分离 容易导致酶结构的改变，从而导致酶活性的下降 化学合成 ② 细胞壁 为真核生物，要对目的基因转录后形成的mRNA作进一步加工后再翻译（或“合成的蛋白质有的还要经内质网、高尔基体的加工，影响N蛋白的生产”） 效应B淋巴（浆） 克隆培养 康复者的血浆中含有多种抗体，缺乏特异性 不能直接进行大规模生产

【解析】

1．基因工程技术的基本步骤：

（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；

（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；

（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；

（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术．个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。

2.单克隆抗体是由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原的抗体。通常采用杂交瘤技术来制备，杂交瘤抗体技术是在细胞融合技术的基础上，将具有分泌特异性抗体能力的效应B细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合为杂交瘤细胞，杂交瘤细胞既能产生抗体，又能无限增殖。用具备这种特性的单个杂交瘤细胞培养成细胞群，可制备针对一种抗原的特异性抗体即单克隆抗体。单克隆抗体的优点是特异性强、灵敏度高，可以大规模生产等优点。

（一）（1）待选菌株初选得到后，先经过在液体培养基中的扩大培养，经稀释涂布到以乳糖为唯一碳源的固体培养基进行培养得到许多的单菌落，根据得到的蓝色透明圈直径与菌落直径比值较大的菌落作为目标菌株。

（2）若乳糖酶为分泌酶，可直接离心取上清液进行酶的分离纯化；若乳糖酶为胞内酶，需先经过细胞破碎处理后，再离心取上清液进行酶的分离纯化。

（3）磁性壳聚糖微球作为载体是与被固定的酶分子形成共价键，说明是化学固定法，由于未形成网状结构，故为共价偶联法。教材中α-淀粉酶的固定方法为吸附法，与吸附法相比较，共价偶联法的主要优点是与酶的结合力大，不易分离，固定效果好，主要缺点是化学结合时容易导致酶的结构发生改变，影响酶的活性。

（二）（1）本例以新冠病毒的N蛋白作为抗原，通过杂交瘤技术制备特异性强的单克隆抗体。N蛋白基因是以其氨基酸序列推算出来的然后用人工方法合成的，这里合成基因的方法应是化学合成法；再利用基因工程技术获得大量的N蛋白，基因工程的核心步骤应是重组DNA的过程即图中的②；将重组DNA导入大肠杆菌时，通常利用氯化钙进行处理，处理的目的是增大细菌细胞壁的通透性，从而提高转化的成功率；在这里不用酵母菌作为受体细胞的主要原因是酵母菌为真核生物，目的基因转录后要加工，并且合成多肽链后还需经过内质网、高尔基体的加工，会影响N蛋白的产生。

（2）过程⑤是利用抗原刺激小鼠，使其体内产生更多的效应B淋巴细胞，过程⑥是杂交瘤细胞的制备过程，经融合、筛选，最后经克隆培养得到相应的杂交瘤细胞株。

（3）单克隆抗体具有的特异性强、灵敏度高，可大量生产的优点，而异体血浆存在供应不足，而且血浆中含有多种抗体，缺乏特异性，同时也易产生免疫排斥反应等，因此与单克隆抗体相比，除了纯度低导致的特异性差，灵敏度低的缺点外，更重要的是不能直接进行大规模生产。