Question

利用基因工程技术培育转基因抗冻番茄。该过程需要用多种限制酶，如图依次表示EcoR I、Sma I、Nae I三种限制酶的识别序列及切割位点。

请回答：

（1）上述限制酶在特定位点切割DNA，其实质是断开DNA分子每条链中特定部位的两个核苷酸之间的____________，切割后产生了_____________。

（2）利用EcoR I和Nae I酶切得某种鱼的抗冻蛋白基因，可与被EcoR I和Sam I酶切后的质粒接成重组质粒，原因是__________________。

（3）重组质粒可用_____________法导入番茄后，应将转基因番茄植株________________________，以确定其耐寒能力是否提高，若没有提高，根据中心法则分析，可能原因是________________________。

（4）欲检测抗冻蛋白基因是否转录出mRNA，需利用______________________作探针。应用PCR扩增目的基因时，需要在基因组数据库中查询目的基因的_____________，以便合成引物。

Answer

磷酸二酯键 黏性末端或平末端 相同的黏性末端之间可连接，且不同的平末端之间也可以连接 农杆菌转化 置于寒冷环境培养 目的基因转录或翻译异常 标记的含有目的基因的DNA片段 核苷酸（或脱氧核苷酸或碱基）序列

【解析】

1、基因工程的工具：
（1）限制酶：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。
（2）DNA连接酶：连接的是两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
（3）运载体：常用的运载体：质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒。
2、基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术．个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。

（1）限制酶能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，产生黏性末端或平末端。
（2）EcoRⅠ酶切出粘性末端，SmaⅠ和NaeⅠ酶切出平末端，利用EcoRⅠ和Nae酶切得某种鱼的抗冻蛋白基因，可与被EcoRⅠ和SamⅠ酶切后的质粒连接成重组质粒，原因是相同的黏性末端之间可连接，且不同的平末端之间也可以连接。
（3）重组质粒可用农杆菌转化法导入番茄后，从个体水平上的鉴定，应将转基因番茄植株置于寒冷环境培养，以确定其耐寒能力是否提高，若没有提高，根据中心法则分析，可能原因是目的基因转录或翻译异常，没有表达出抗冻蛋白。

（4）欲检测抗冻蛋白基因是否转录出mRNA，需利用标记的含有目的基因的DNA片段作探针。应用PCR扩增目的基因时，需要在基因组数据库中查询目的基因的核苷酸（或脱氧核苷酸或碱基）序列，以便合成引物。