Question

pIJ702是一种常用质粒，其中tsr为硫链丝菌素（一种抗生素）抗性基因，mel是黑色素合成基因，其表达能使白色的链霉菌菌落变成黑色菌落：而限制酶A、B、C、D在pIJ702上分别只有一处识别序列。以B和C切取的目的基因置换pIJ702上0．4kb（1kb=1000对碱基）的B/C片段，构成重组质粒，如图。

1.构成重组质粒时除了限制酶还需用到工具酶是_____________。上述基因工程中的受体细胞是_____________（硫链丝菌/链霉菌）细胞。

2.将上述两种质粒的限制酶酶切片段长度列在表中。

限制酶	pIJ702	重组质粒
A	5．7	1．6Kb，5．1Kb
D	5．7	2．2Kb，4．5Kb

由此判断目的基因内部是否含有限制酶A、D切割位点，其情况是目的基因中            。

A.只有A酶切割位点 B.只有D酶切割位点

C.两者都有切割位点 D.两者都没有切割位点

不含质粒的链霉菌在含硫链丝菌素固体培养基上的生长状况如表所示。

固体培养基中硫链丝菌素浓度（ug/mL）	0	1	2	5	10
不含质粒的链霉菌生长状况	+++++	+++	+	-	-

“+”表示生长；“-”表示不生长

3.若要筛选接纳了pIJ702或重组质粒的链霉菌细胞，所需的硫链丝菌素最小浓度应为____________ug/mL（填写表3中给定浓度）；含有重组质粒的菌落呈____________（白/黑）色。

4.上述目的基因来源于原核生物，其蛋白质编码序列（即编码从起始密码子到终止密码子之间的序列）经测定为1256对碱基，试判断对这段序列的测定是否存在错误？并说明依据。____________。

Answer

1. DNA连接酶 链霉菌

2.C

3. 5 白

4.错误，原核生物决定每个氨基酸的密码为三联密码，所以基因的编码碱基序列应为3的整数倍

【解析】

基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。

1.构建重组质粒需要用限制性核酸内切酶切割质粒和目的基因，还需要使用DNA连接酶将相同的末端连接起来，所以构成重组质粒时除了限制酶还需用到工具酶是DNA连接酶。mel是黑色素合成基因，其表达能使白色的链霉菌菌落变成黑色菌落，分析示意图，目的基因是插入到了mel基因中，所以不能再使白色的链霉菌菌落变成黑色菌落，便于筛选，所以此时的受体细胞应该是链霉菌。

2.pIJ702经限制酶A或D切割，均获得5.7kb的片段，说明pIJ702上存在限制酶A、D各一个识别位点，重组质粒经限制酶A或D切割，均获得两种片段，说明pIJ702上存在限制酶A、D各两个识别位点，级目的基因内部含有限制酶A、D各一个切割位点，C正确。

故选C。

3.从不含质粒的链霉菌在含硫链丝菌素固体培养基上的生长状况表格可以看出，硫链丝菌素浓度低于5ug/mL时，链霉菌能够生长，因此所需的硫链丝菌素最小浓度应为5ug/mL；mel是黑色素合成基因，其表达能使白色的链霉菌菌落变成黑色菌落，由于mel基因被替换后，链霉菌菌落不能变黑，而成为白色。

4.原核生物的编码区是连续的，由于决定每个氨基酸的碱基序列为三个相连的碱基，所以基因的编码碱基序列应为3的整数倍，而基因中1256对碱基转录成的mRNA含有从起始密码到终止密码有1256个碱基，不能被3整除，故测序肯定错误。