Question

玉米是我国重要的粮食作物和饲料来源，低温会影响玉米的产量和品质。研究者将从微生物中获得的CSP（冷激蛋白）基因与玉米基因的ubi启动子相连后构建基因表达载体，并将其导入玉米细胞中，获得了具有低温耐受性的玉米植株，过程如图1所示。

（1）研究者提取玉米的DNA，利用PCR技术将ubi启动子扩增出来。该过程需设计合适的引物，引物设计时需已知___________，为便于进行后续操作还在引物中添加了限制酶的识别序列。在反应体系内，至少需___________次扩增才能获得所需的ubi启动子。

（2）图1所示的流程图中，过程①需___________的催化，获得的ubi-CSP基因在构建基因表达载体时，在Ti质粒上的插部位为___________。过程②需要用CaCl₂溶液处理农杆菌，其目的是___________。过程③完成后，将玉米愈伤组织转入含___________的培养基中进行筛选，筛选后的愈伤组织再经培育获得转基因玉米。

（3）研究者分别提取了野生型玉米及5株转基因玉米的染色体DNA，用限制酶处理后进行电泳。电泳后的DNA与基因探针进行杂交，得到图2所示放射性检测结果，该基因探针应为___________片段，实验结果表明___________。

（4）在个体水平上对转玉米植株进行___________实验，可检测CSP基因是否已在玉米中表达。

Answer

ubi两端的一段序列 3 限制酶和DNA连接酶 T-DNA内部（且不破坏hpt） 获得感受态细胞（或:使农杆菌处于易于吸收外源DNA的状态） 潮霉素 含放射性同位素标记的CSP基因 除植株3外，其他4株转基因玉米中CSP基因均已整合到玉米染色体基因组中 低温耐受性

【解析】

基因工程技术的基本步骤：

（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；

（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；

（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；

（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。

（1）在利用PCR技术进行扩增时，需要事先设计引物，这里需要根据ubi启动子设计合适的引物，因此需已知ubi两端的一段序列，为便于进行后续操作还在引物中添加了限制酶的识别序列。在反应体系内，至少需3次才能获得引物之间的核苷酸序列，即至少需3次扩增才能获得所需的ubi启动子。

（2）图1中，过程①为载体和目的基因相连的过程，因此需限制酶和DNA连接酶的催化从而实现连接，在获得ubi-CSP基因构表达载体时，需要将ubi-CSP基因插入T-DNA内部（且不破坏hpt），这样能保证T-DNA转移时携带目的基因与玉米的染色体DNA连接。过程②为导入受体细胞的过程，为了提高导入的成功率，通常用CaCl2溶液处理农杆菌，使其成为感受态细胞，因为处于感受态的农杆菌易于吸收外源DNA，过程③完成后，将玉米愈伤组织转入含潮霉素的培养基中进行筛选，筛选后的愈伤组织再经脱分化过程长成幼苗，从而获得了转基因玉米植株

（3）图2所示放射性检测结果，因此这里的基因探针为含放射性同位素标记的CSP基因片段，实验结果显示在第1、2、4、5株玉米中检测出目的基因的放射性，据此可知除植株3外，其他4株转基因玉米中CSP基因均已整合到玉米染色体基因组中。

（4）在个体水平上，可以通过对转玉米植株进行低温耐受性实验，进而检测CSP基因是否在玉米中成功表达。