Question

自然界中有很多种微生物，尚未能分离纯化培养，科研人员开发了新的微生物分离 技术以筛选微生物。

（1）配制培养基并分离微生物的步骤是：计算→称量→溶化→调pH→______________→倒平板→______________→培养。筛选微生物的一般思路是，根据表型特征利用____培养基进行筛选。

（2）若某种微生物没有明显表型特征时，就无法通过上述方法筛选，科研人员通过图所示的流程进行筛选。

①据图分析，科研人员利用目标微生物编码膜蛋白的____________________，构建表达载体，并导入用________________处理的大肠杆菌细胞中，获取大量膜蛋白。

②用获取的膜蛋白作为抗原，利用兔子制备单克隆抗体的具体流程是：_____。

（3）将上述带有荧光的单克隆抗体与待分离微生物群体混合，目的是_____目标微生物。 用流式细胞仪分离不同荧光强度的细胞，结果如图2所示。对结果进行比较，应从区域_____（选填图中数字）的细胞中筛选目标微生物。

Answer

（高压蒸汽）灭菌 接种 选择 基因序列 CaCl2 用膜蛋白作为抗原多次免疫兔子，取脾脏中的B淋巴细胞（或浆细胞）与骨髓瘤细胞融合，筛选得到单个分泌抗膜蛋白抗体的杂交瘤细胞，进行克隆培养 标记 ②

【解析】

单克隆抗体的制备过程：首先用特定抗原注射小鼠体内，使其发生免疫，小鼠体内产生具有免疫能力的B淋巴细胞。利用动物细胞融合技术将B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合，单克隆抗体制备过程中的两次筛选：第一次筛选：利用特定选择培养基筛选，获得杂交瘤细胞，即AB型细胞（A为B淋巴细胞，B为骨髓瘤细胞），不需要A、B、AA、BB型细胞。第二次筛选：利用多孔板法和抗原-抗体杂交法筛选，获得产生特定抗体的杂交瘤细胞。最终筛选获得的杂交瘤细胞的特点是能无限增殖并能分泌特异性抗体，最后从培养液或小鼠腹水中提取单克隆抗体。

（1）制备固体平板培养基的主要操作步骤是：计算→称量→溶化→调pH→灭菌→倒平板→接种→培养。选择培养基可以抑制其它微生物生长，而有利于目的菌的生长，所以筛选微生物一般使用选择培养基。

（2）①据图分析，科研人员利用基因工程将目标微生物编码膜蛋白的基因序列，构建基因表达载体，并导入用CaCl2处理的大肠杆菌细胞中，使目的基因增殖并表达可获取大量膜蛋白。

②用获取的膜蛋白作为抗原，利用兔子制备单克隆抗体的具体流程是：用膜蛋白作为抗原多次免疫兔子，使其体内产生针对该膜蛋白的免疫细胞，取脾脏中已经免疫的B淋巴细胞（或浆细胞）与骨髓瘤细胞融合，通过选择培养基的筛选和抗体检测可筛选得到单个分泌抗膜蛋白抗体的杂交瘤细胞，并进行体内或体外的克隆培养。

（3）利用抗体和抗原特异性结合的特性，可将上述带有荧光的单克隆抗体与待分离微生物群体混合，目的是标记目标微生物。加入抗体后荧光性强的场所说明含有目标微生物多，所以据图可知应从区域②的细胞中筛选目标微生物。