Question

qRT-PCR又称实时荧光定量PCR，是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测定每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物的总量，间接对待测样品中特定DNA序列进行定量分析的方法。qRT-PCR实验步骤：反转录→扩增→检测。qRT-PCR目前主要应用于基因表达水平的检测。请回答下列有关问题：

（1）反转录：在___________酶的作用下，mRNA反转录形成cDNA分子；cDNA与原基因相比，在结构上的不同点有_________________________________。

（2）扩增：用PCR扩增cDNA，首先要制备___________种引物，以便为___________酶提供结合位点，并从引物的___________（填“5′”或“3′”）端开始拼接单个的脱氧核苷酸。

（3）检测：利用荧光标记的化学物质是____________________，随着PCR反应的进行荧光信号强度也等比例增加。

（4）qRT-PCR对基因表达的检测仅限于___________水平，而对于翻译水平的检测常用的方法是___________。

Answer

逆转录（或反转录） cDNA中不具有启动子和终止子等调控因子 2 热稳定DNA聚合（或Taq） 3′ 4种脱氧核苷酸（或dNTP） 转录 抗原一抗体杂交实验

【解析】

1、PCR技术：

（1）概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。

（2）原理：DNA复制。

（3）前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序列以便合成一对引物。

（4）条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）。

（5）过程：①高温变性：DNA解旋过程（PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开）；低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。

（1）由于该技术是在逆转录酶的作用下，由mRNA反转录产生的双链cDNA片段，因此只包含该种生物的部分基因。与原基因相比，缺少原基因结构中的启动子和终止子等调控因子以及编码区的内含子等，因此获得的cDNA与原基因的碱基序列不同。

（2）利用PCR反应扩增核酸片段，首先要有一段已知的该核酸片段的核苷酸序列，以便以这一核苷酸序列为模板合成引物，因为DNA是双链，引物需制备两种，为热稳定DNA聚合（或Taq）提供结合位点。由于DNA聚合酶只能从核苷酸链的3＇端开始延伸DNA链，故引物是从3＇端开始拼接单个的脱氧核苷酸进行PCR扩增。除引物外，PCR反应体系中还包含缓冲液、模板DNA、dNTP和Taq 酶等成分。

（3）检测PCR产物用到的荧光探针指的是荧光标记的4种脱氧核苷酸（或dNTP）。随着DNA扩增次数的增加，荧光的强度会逐渐增大，荧光信号的变化与PCR产物的形成完全同步。

（4）qRT-PCR是以荧光化学物质测定每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物的总量，qRT-PCR对基因表达的检测仅限于转录水平。翻译的产物是蛋白质，从分子水平检测基因是否翻译成蛋白质的常用方法是抗原-抗体杂交法。