Question

人乳铁蛋白（hLF）对细菌、真菌和病毒等都有抑制作用。研究人员开展人乳铁蛋白基因乳腺特异性表达载体构建及转染研究，主要流程如下图，图中Ase I  Nhe I、Sal I、BamH I代表相关限制酶切点，neo′为新霉素抗性基因，BLG基因为β-乳球蛋白基因，GFP基因为绿色荧光蛋白基因。请回答：

（1）过程①中，不能从人肌肉细胞中提取RNA用于RT-PCR，是因为_________。在RT-PCR过程中，加入的引物需在5'端添加____________两种限制酶的识别序列，以便于hLF基因插入pEB中。

（2）过程②中，hLF基因插入到BLG基因之后的目的是______________。过程③中，使用人工膜制成的脂质体将重组质粒导入受体细胞，依据的主要原理是_____________。

（3）将转染后的山羊乳腺上皮细胞先置于含新霉素的培养液中培养，能够存活的细胞应该是导入____________的细胞，再利用荧光显微镜观察山羊乳腺上皮细胞中___________，以筛选出转染成功的细胞。

（4）要获得转基因山羊，还需要将成功表达hLF的乳腺上皮细胞的细胞核移植到山羊__________细胞中，再借助_____________技术孕育出羊羔。

Answer

hLF基因在人肌肉细胞中不转录（表达） Sal I和BamH I 使人乳铁蛋白基因在山羊的乳腺细胞中表达 生物膜具有一定的流动性 pEB质粒或pEBL质粒 是否有绿色荧光 去核的卵母 早期胚胎培养和胚胎移植

【解析】

基因工程技术的基本步骤：

（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。

（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。

（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。

（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。

（1）人肌肉细胞使高度分化的细胞，hLF基因在人肌肉细胞中不转录（表达），故过程①中，不能从人肌肉细胞中提取RNA用于RT-PCR。Sal I和BamH I在质粒上挨着，切割质粒不破坏其他基因，故在RT-PCR过程中，加入的引物需在5'端添加Sal I和BamH I两种限制酶的识别序列，以便于hLF基因插入pEB中。

（2）过程②重组载体的构建，hLF基因插入到BLG基因之后的目的是使人乳铁蛋白基因在山羊的乳腺细胞中表达。过程③重组载体导入受体细胞，使用人工膜制成的脂质体将重组质粒导入受体细胞，依据的主要原理是生物膜具有一定的流动性。

（3）neo′为新霉素抗性基因，具有抗新霉素的作用，故将转染后的山羊乳腺上皮细胞先置于含新霉素的培养液中培养，能够存活的细胞应该是导入pEB质粒或pEBL质粒的细胞，GFP基因为绿色荧光蛋白基因，作为标记基因，可再利用荧光显微镜观察山羊乳腺上皮细胞中是否有绿色荧光，以筛选出转染成功的细胞。

（4）要获得转基因山羊，还需要将成功表达hLF的乳腺上皮细胞的细胞核移植到山羊去核卵母细胞中，再借助早期胚胎培养和胚胎移植技术孕育出羊羔。