Question

人们对富含纤维素的木材废料、废纸、农作物残渣等进行简单堆积或焚 烧，不仅浪费资源而且污染环境。研究人员将放线菌的纤维素酶基因导入大肠杆 菌体内，构建高表达纤维素酶的工程菌，提高纤维素降解效率，降低成本且环保。 请回答问题：

（1）在富含 ____的土壤中采集土样，放入培养基中培养一段时间后，利用 ____ 法将菌液接种筛选培养基上。培养一段时间后，挑取不同形态、颜色的 ____ 进行分离及纯化，获得纯培养物。再接种到筛选鉴定培养基上，培养观察、 测量并记录 ____，结果如下表：

菌株名称	菌落直径（cm）	降解圈直径（cm）
D1	1.75	2.6
D3	1.90	2.7
D4	1.50	2.2
H1	1.16	2.3
H2	1.15	1.8
Lb1	0.45	1.4

由表可知菌株____为目标菌株，降解纤维素能力最强。

（2）为获取纤维素酶高表达的工程菌，进行下列实验操作。

①从目标菌株中获取____，研究发现目标菌株内与产纤维素酶有关的基因共有 3 种，其中有两种基因已研究并被命名，选取未被命名的且标识为 5676的基因（长度为 1044 bp）进行克隆并使其在大肠杆菌中得到表达。

②选取质粒 p 构建纤维素酶重组表达载体（ p-5676），____ 到大肠杆菌 DH5α，在抗性培养基过夜培养，抽提质粒经过 Nde I 和 Kpn I 双酶切验证 结果如图 1 所示，其中 2为____经酶切电泳的结果。通过对重组质粒测序，验证连接到质粒的基因与目的基因一致，说明____。

③将 p-5676 转入BL21菌株，获得表达菌株BL21（5676），还应将____得到对照菌株 BL21（p），经液体培养抽提质粒酶切验证，结果如图 2 所示， 说明纤维素酶表达菌种构建成功。

④分别测定表达菌株BL21（5676）培养液和对照菌株 BL21（p）培养液的____，如果前者显著大于后者，表明高效表达纤维素酶的工程菌培育 成功，可用于生产实践。

（3） 综上研究，表达菌株 BL21（5676）培养液 ____（属于/不属于）发酵液。高效降解纤维素的工程菌成功构建，为其在工业中的应用打下良好基础，未 来后续研究重点你认为可放在哪些方面？ ____。

Answer

枯枝落叶（或纤维素） 稀释涂布 菌落 菌落和透明圈直径 Lb1 目的基因 导入 重组表达载体（p-5676） 重组表达载体（p-5676）的构建是成功的 质粒p 葡萄糖含量 属于 可重点放在发酵工艺的优化，使得纤维素酶在菌株中得到更高量的表达

【解析】

纤维素分解菌可以产生纤维素酶，能将纤维素分解为葡萄糖。筛选并鉴定纤维素分解菌会用到刚果红染色法，刚果红能和纤维素形成红色复合物，当纤维素分解菌产生纤维素酶，周围的纤维素被分解，则不能形成红色复合物，此时就会形成以菌落为中心的透明圈。基因工程的流程包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。

（1）生物与环境相适应，为了找到纤维素分解菌，应该在纤维素含量丰富的地方寻找。微生物接种的方法有平板划线法和稀释涂布平板法，稀释涂布平板法接种的范围更广，充分利用的选择培养基，最终产生的菌落分散得更均匀，能得到更多的单菌落，能在选择培养基上生长的菌落能分解纤维素。为了从分离得到的众多菌落中筛选出分解纤维素能力最强的，应该测量菌落和透明圈直径，如果两者的差距大，即透明圈直径/菌落直径的比值越大的话，说明分解能力越强，Lb1组比值最大，说明Lb1组降解纤维素能力最强。

（2）①要想实现通过基因工程获得纤维素高表达的工程菌，首先要获取与纤维素酶高表达相关的目的基因。②之后与运载体（如质粒）构建基因表达载体，构建好之后将重组质粒导入受体细胞大肠杆菌DH5α。用Nde I 和 Kpn I 双酶切质粒，2中出现长度为1000bp左右的片段，极有可能为目的基因5676基因（长度为1044bp），所以2应该是重组表达载体经酶切电泳的结果，所以能得到5676的目的基因，通过对重组质粒测序，能测到目的基因序列，说明基因表达载体的构建是成功的。③如果导入受体细胞的不是重组质粒，而是质粒p，则经过酶切不能得到5676基因，即长度为1044bp左右的片段。④纤维素被分解产生葡萄糖，如果高效表达纤维素酶的工程菌培育成功，则培养液中葡萄糖的含量应该比较多。

（3）表达菌株 BL21（5676）可用于大量生产葡萄糖，其培养液就是发酵液，后续应用到生产中注意保有纤维素酶的高表达的特性，保证产物的高产。