Question

为了研究视神经病变诱导基因（OPTN）的分子机制，科研人员用OPTN基因的部分DNA片段构建表达载体，导入细胞后转录出的RNA会抑制细胞中OPTN蛋白的合成。实验中使用的DNA片段和载体上限制酶的识别序列如下：

限制酶	BglⅡ	BamHⅠ	HindⅢ	XhoⅠ
识别序列和切割位点	A↓GATCT TCTAG↑A	G↓GATCC CCTAG↑G	A↓AGCTT TTCGA↑A	G↓TCGAG GAGCT↑C

请回答：

（1）应选用BamHⅠ和HindⅢ切割载体质粒，理由是____________。

（2）重组质粒上____________（填“有”或“无”）BamHⅠ的识别序列，因此可通过酶切法鉴定质粒是否重组成功，方法如下：用BamHⅠ和XhoⅠ两种限制酶处理质粒，未重组的质粒将产生____________种片段，重组的质粒将产生____________种片段。

（3）重组质粒导入细胞后，能抑制细胞中OPTN蛋白合成的原因是____________。

（4）要证明导入重组质粒的细胞中OPTN基因的表达受到抑制，需要设置____________作为对照组。通常采用____________法检测细胞中OPTN蛋白的表达水平。

Answer

目的基因片段和质粒上均含有HindⅢ的酶切位点；BamHⅠ与BglⅠ处理产生的黏性末端相同；BamHⅠ和HindⅢ处理质粒后能保证目的基因插入质粒的启动子和终止子之间 无 2 1 重组质粒中OPTN基因部分片段转录产生的mRNA与细胞中指导OPTN蛋白合成的mRNA互补结合，阻碍了翻译过程的进行 导入未重组质粒（和未导入质粒）的细胞 抗原—抗体杂交

【解析】

分析题图可知，OPTN基因的部分片段上有限制酶BglⅡ和HindⅢ的酶切位点，质粒上有限制酶BamHⅠ、HindⅢ和XhoⅠ的酶切位点。一个基因表达载体必须包括目的基因、启动子、终止子、标记基因等。启动子是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需蛋白质。终止子位于基因的尾端，使转录在所需的地方停止下来。

（1）由图示可知，目的基因片段和质粒上均含有HindⅢ的酶切位点，由表格信息可知，限制酶BamHⅠ与BglⅠ切割后产生的黏性末端相同，由于目的基因需要插入到启动子和终止子之间才能正常表达，因此选用限制酶BamHⅠ和HindⅢ切割质粒，用限制酶BglⅠ和HindⅢ切割目的基因后，能保证目的基因插入质粒的启动子和终止子之间。

（2）由表格分析可知，质粒经过BamHⅠ切割后的黏性末端与目的基因上经BglⅡ切割后的黏性末端相连后的序列不能被BamHⅠ识别，即重组质粒上没有BamHⅠ的识别位点，因此可通过酶切法鉴定质粒是否重组成功。若用BamHⅠ和XhoⅠ两种限制酶处理质粒，未重组的质粒能被两种限制酶切割，产生2种片段，重组质粒只能被XhoⅠ切割，产生1种片段。

（3）由于重组质粒中含有OPTN基因部分片段，因此当重组质粒导入细胞后，其上的OPTN基因部分片段转录出的mRNA能与细胞中指导OPTN蛋白合成的mRNA互补结合，阻碍了翻译过程的进行，从而抑制细胞中OPTN蛋白的合成。

（4）要证明导入重组质粒的细胞中OPTN基因的表达受到抑制，需要设置导入未重组质粒（和未导入质粒）的细胞作为对照组。通常采用抗原—抗体杂交法检测细胞中OPTN蛋白的表达水平，若无杂交带出现，表明OPTN基因的表达受到抑制。