Question

正常细胞中含有抑癌的 P53 基因，能表达抗病毒蛋白，帮助修复轻度变异的基因，也能使重复变异的细胞发生凋亡而避免肿瘤的发生；若它失活而不能表达，则基因突变的细胞易形成肿瘤。基因治疗肿瘤是根本的方法，腺病毒以其嗜好增殖细胞和对人体基本无害而成为良好的基因载体。野生型腺病毒含有抑制 P53 基因活性的 55Kda 基因，以及病毒复制基因 E1，因此需要重新构建有疗效的、安全的腺病毒。图甲、乙中箭头所指为相应限制酶切点。

（1）DNA 解旋酶直接作用于脱氧核苷酸之间的_____键（化学键）；限制酶直接作用于脱氧核苷酸之间的_____键（化学键）。

（2）构建重组腺病毒时，限制酶最好选择____，理由是：既可以去除_____基因以防止病毒复制后损伤健康细胞，同时还能破坏_____基因以防止其_____。

（3）在基因工程操作中，检测目的基因是否发挥功能的第一步是_____，检测方法是____技术，若出现杂交带，则表明成功。

（4）如果需将目的基因利用 PCR 技术扩增 10 次，则需要在缓冲液中至少加入____个引物。A．2¹⁰B．2¹⁰+2 C．2¹¹D．2¹¹-2

（5）PCR 扩增目的基因的前提是_____，以便根据这一序列合成引物。PCR 需提供_____， 引物，dNTP，DNA 模板。反应结束后，可以利用 DNA 的_____特点进行 DNA 含量的测定。

Answer

氢 磷酸二酯键 BamHI 和 EcoRI E1 55kda 抑制 P53 基因的活性 检测目的基因是否转录出 mRNA 分子杂交 D 有一段已知目的基因的核苷酸序列 Taq 酶 DNA 在 260nm 的紫外线波段有一强烈的吸收峰

【解析】

分析题图：图甲为野生型腺病毒DNA，其中含有抑制P53基因活性的55Kda基因，以及病毒复制基因E1，因此构建基因表达载体时应破坏或去除55Kda基因和基因E1；

图乙为人体DNA片段，其中P53基因为目的基因．要获得目的基因（P53基因），同时还要破坏或去除55Kda基因和基因E1，应选用EcoRI和BamHI切割载体和含有目的基因的DNA。

（1）DNA 解旋酶直接作用于脱氧核苷酸之间的氢键，使DNA的双链解开螺旋；限制酶直接作用于脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键。

（2）根据题干信息“野生型腺病毒含有抑制P53基因活性的55Kda基因，以及病毒复制基因E1”可知，构建基因表达载体时，应选用EcoRI和BamHI切割载体和含有目的基因的DNA，这样既可以去除E1基因以防止病毒复制后损伤健康细胞，同时还能破坏55Kda基因以防止其抑制P53基因的活性。

（3）在基因工程操作中，检测目的基因是否发挥功能作用的第一步是检测目的基因是否转录出了mRNA，检测方法是分子杂交技术，用标记的目的基因作探针与mRNA杂交，若出现杂交带，则表明目的基因转录出了mRNA。

（4）利用PCR技术将目的基因扩增N次，至少需要的引物2N+1-2个，如果需将目的基因利用 PCR 技术扩增 10 次，则需要在缓冲液中至少加入211-2个引物，故选D。

（5）PCR 扩增目的基因的前提是有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物。PCR 需提供Taq 酶，引物，dNTP，DNA模板。反应结束后，可以利用 DNA 的DNA 在 260nm 的紫外线波段有一强烈的吸收峰特点进行 DNA 含量的测定。