Question

对硝基苯酚（pNitrophenol，PNP）属于硝基苯酚类化合物（水溶液为黄色），主要来源于农药、医药、染料、塑料等生产企业的排放，对植物、微生物、动物均有毒性。某研学小组从活性污泥中分离到一株PNP降解菌，对其形态、生理生化及降解特性进行研究。回答下列问题：

（1）取采自污水处理厂的活性污泥转接至富集培养液中，培养液配方如下表：

NH4NO3	酵母膏	KH2PO4	K2HPO4	NaCl	MgSO4·7H2O	FeSO4	PNP	蒸馏水	pH
1 g	0．5 g	0．5 g	1．5 g	1 g	0．1 g	0．025 g	0．1 g	1 L	7．0

该培养液________（填“是”或“不是”）以PNP为唯一碳源，富集过程中连续转接至新鲜的富集培养液中5次，该步骤的目的是______________________________。

（2）将富集液进行梯度稀释，取适量稀释菌液在LB固体培养基上利用稀释涂布平板法进行分离，需要用到下图中的实验器材有________。在培养过程中，需放置________培养基一起培养，来检验培养基是否受到污染。

（3）挑取LB培养基上的单菌落转接到300 mg/L PNP的固体培养基上，按功能划分，该培养基属于________培养基；以菌落周围产生________作为筛选标记，最终得到一株降解能力较强的降解菌，命名为P62。

（4）下图是探究环境因素影响P62降解效果的实验数据。据图1分析，当温度在30 ℃左右时，P62的降解效果较好，推测可能的原因是________。据图2分析，在250 mL锥形瓶中的装液量为180 mL时，会明显抑制降解效果，推测________对降解效果影响较大。

Answer

不是 不断提高PNP降解菌的菌体密度（富集PNP降解菌、提高PNP降解菌数量、浓度等说出增加降解菌的量） ②③④ 未接种的（LB）（未接种或空白培养基） 鉴别 透明圈（水解圈） （PNP降解酶的最适温度在30 ℃左右（相关酶的适宜温度在30 ℃左右） 通气量（O2浓度、溶氧量、空气量）

【解析】

该研学小组的目标是提取出高效的PNP降解菌。其分离过程大致为：活性污泥取样→选择培养→梯度稀释→涂布平板→在鉴别培养基上挑选菌落。

（1）该培养基配方中的碳源有PNP、酵母膏，所以PNP并不是唯一碳源。让微生物在新鲜的富集培养液中连续培养5次，增加PNP降解菌的数量，保证后续能分离得到PNP降解菌的菌落。

（2）稀释涂布平板法需要用滴管将少量菌液滴加到培养基表面，之后将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃灭菌，用冷却后的涂布器将菌液均匀地涂布在培养基的表面，使菌液分布均匀，并且涂布平板的所有操作都应在酒精灯附近进行。需要用到②涂布器、③滴管、④酒精灯。为了检验培养基是否受到污染，将未接种的培养基一起培养，如果其上长出菌落，则证明培养基受 到了污染，需要重新制备。

（3）高浓度的 PNP的固体培养基是鉴别培养基，培养基因为PNP呈现黄色，如果菌落为PNP降解菌的菌落，则其周围的PNP被降解，所以会以菌落为中心形成一个透明圈，透明圈的比例越大，则说明降解效果越好。

（4）P62的降解效果与其产生的酶有关，温度可能会影响酶的活性，30 ℃左右时降解效果最好，可能此时为酶的最适温度，此温度下酶活性最高。如果容器内的溶液量过多，则剩余空间所能容纳的空气就有限，此时氧气量就少，溶液中的溶氧量较少，影响了P62的有氧呼吸，合成酶是需要能量的，酶量少降解效果就差，所以通气量对降解效果影响较大。