Question

苯丙酮尿症是由于患者PKU基因突变引起体细胞中缺少一种酶，致使体内的苯丙氨酸代谢异常转化为苯丙酮酸，从而导致患者神经系统损害。将正常PKU基因定点整合到PKU基因突变的小鼠胚胎干细胞的染色体DNA上来替换突变基因，可用来研究该病的基因治疗过程。定点整合的过程是：从染色体DNA上突变PKU基因两侧各选择一段DNA序列HB1和HB2，根据其碱基序列分别合成HB1和HB2，再将两者分别与基因K1、K2连接，中间插入正常PKU基因和标记基因neo^r，构建出如图所示的重组载体。重组载体和染色体DNA中的HB1和HB2序列发生交换，导致两者之间区域发生互换，如图所示。回答下列问题：

（1）上图中通过基因定点整合可替换特定基因，该技术可用于单基因遗传病的治疗，该技术的应用原理属于________。该实验用小鼠胚胎干细胞作为PKU基因的受体细胞以培育出转基因小鼠，除了胚胎干细胞能大量增殖外，还因为胚胎干细胞________。

（2）实验中小鼠胚胎发育到囊胚期时，聚集在胚胎一端，个体较大的细胞是______________，可将其取出并分散成单个细胞进行培养，将来可为实验提供所需的胚胎干细胞。培养过程中培养液除了一些无机盐和有机盐外，还需要添加“两酸、两素”以及动物血清，其中的“两酸”是指________，培养过程中大部分细胞会贴附在培养瓶的表面生长，当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为________。

（3）用图中重组载体转化胚胎干细胞时，会出现PKU基因错误整合。错误整合时，载体的两个K基因中至少会有一个与neo^r一起整合到染色体DNA上。已知含有neo^r的细胞具有G418的抗性。 K1、K2的产物都能把DHPG转化成有毒物质而使细胞死亡。转化后的胚胎干细胞依次在含有G418及同时含有G418和DHPG的培养液中进行培养，在双重选择下存活下来的是________的胚胎干细胞，理由是____________________________。

（4） 将筛选得到的胚胎干细胞培育成小鼠，从个体生物学水平检测，若小鼠尿液中________，说明PKU基因成功表达。

Answer

基因重组 具有发育的全能性（全能性） 内细胞团 氨基酸和核苷酸 细胞的接触抑制（接触抑制） 正确整合（含neor而不含K基因）（含neor而不含K1或K2基因） 能在含有G418的培养液存活说明转化后的胚胎干细胞中含neor，能在含DHPG的培养液中存活说明转化后的胚胎干细胞中不含K基因 不含大量苯丙酮酸（苯丙酮酸含量在正常范围内）

【解析】

DNA重组技术至少需要三种工具：限制性核酸内切酶（限制酶）、DNA连接酶、运载体。构建重组载体时，首先需用限制性核酸内切酶切割目的基因和运载体，再用DNA连接酶连接目的基因和运载体形成重组载体。胚胎干细胞简称ES或EK细胞，来源于早期胚胎或原始性腺（即囊胚期的内细胞团），因此获取的胚胎干细胞应取自囊胚的内细胞团。结合题图可知，互换后的小鼠染色体DNA，与小鼠染色体DNA比较，HB1和HB2的碱基分别替换成了重组载体的HB1′和HB2′，并且增加了重组载体的neor为新霉素抗性基因，原来突变的PKU基因，替换成了正常的PKU基因。

（1）利用基因工程技术将基因定点整合可替换特定基因，利用的原理是基因重组。胚胎干细胞具有发育的全能性，且能大量增殖，常被用作受体细胞。

（2）当胚胎发育到囊胚时期时，聚集在胚胎一端，个体较大的细胞是内细胞团，将来可发育成胚胎的各种组织。胚胎培养液中除了一些无机盐和有机盐外，还需要添加“两酸、两素”以及动物血清，其中的“两酸”是指氨基酸和核苷酸。动物细胞培养过程会出现贴壁生长，出现接触抑制现象。

（3）由题意可知，转化后的各类胚胎干细胞要依次在含有G418和同时含有G418和DHPG的培养液中培养，在双重选择下存活并增值的是正确整合的胚胎干细胞，原因是能在含有G418的培养液存活说明转化后的胚胎干细胞中含neor，能在同时含G418和DHPG的培养液中存活说明转化后的胚胎干细胞中含neor且不含HSV-tk。

（4）苯丙酮尿症患者体内缺乏一种酶，导致体内苯丙氨酸不能转化为酪氨酸，而大量转化为苯丙酮酸，在体内积累，随尿液排出，若转基因小鼠的尿液中不含大量苯丙酮酸，说明PKU基因正常表达。