Question

下图为某种质粒表达载体简图，小箭头所指分别为限制性内切酶EcoRI、BamHI的酶切位点，amp^R为青霉素抗性基因，tet^R为四环素抗性基因，P为启动子，T为终止子，ori为复制原点。已知目的基因的两端分别有包括EcoRI、BamHI在内的多种酶的酶切位点。

据图回答：

（1）将含有目的基因的DNA与质粒表达载体分别用EcoRI 酶切，酶切产物用DNA连接酶进行连接后，其中由两个DNA片段之间连接形成的产物有_______________、_____________、__________三种。若 要从这些连接产物中分离出重组质粒，需要对这些连接产物进行____________。

（2）用上述3种连接产物与无任何抗药性的原核宿主细胞进行转化实验。之后将这些宿主细胞接种到含四环素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物是_________；若接种到含青霉素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物是_________。

（3）目的基因表达时，RNA聚合酶识别和结合的位点是_________，其合成的产物是_________。

（4）在上述实验中，为了防止目的基因和质粒表达载体在酶切后产生的末端发生任意连接，酶切时应选用的酶是_______。

Answer

目的基因—载体连接物 载体—载体连接物 目的基因—目的基因连接物 分离纯化 载体—载体连接物 目的基因—载体连接物、载体—载体连接物 启动子 mRNA EcoRI和BamHI

【解析】

用上述两种限制酶同时切割目的基因后，目的基因的两个黏性末端不同，这样目的基因就不会自连成环状。同样用上述两种限制酶同时切割质粒后，质粒的两个黏性末端也不同，这样质粒也不会自连。这样当把切割后目的基因和切割后质粒混合后，只有目的基因和质粒才能相连。产物中只有重组质粒，而无其他的连接产物。

（1）用EcoRI酶切出的目的基因和质粒具有相同的黏性末端，如果放在一起加入DNA连接酶，则可出现三种连接结果，即会出现目的基因自身形成的连接物，载体自身形成的连接物和重组质粒，要通过筛选、纯化才能选出符合要求的DNA。

（2）载体自身形成的连接物能重新形成完整的tetR基因，具有抗四环素的特点，其他连接物中tetR基因被限制性内切酶破坏，不再具有抗四环素的特点；在整个操作过程中，ampR基因保持完整，质粒自身形成的连接物和重组质粒都具有抗青霉素的特性。

（3）RNA聚合酶与相关基因的启动子结合，完成的是转录过程。

（4）将含有目的基因的靶DNA片段和载体分别用两个不同的限制性内切酶切割，使两种DNA片段自身的5′和3′黏性末端不同，但二者相同末端又互补，这明显减少靶DNA片段和载体自身环化与串连，使外源DNA片段能正确插入载体启动子下游。在本题中目的基因两端有EcoRI酶切点和BamHI酶切点，在质粒载体上也有这两种酶的切点，所以可以用这两种酶切出非同源性互补末端来阻止其他连接。