Question

基因工程的相关技术可用于病毒检测，也可用于制备疫苗。利用荧光PCR技术检测是否感染某种RNA病毒时，基本操作流程为：提取病毒的RNA→荧光PCR扩增反转录DNA→荧光检测。请回答下列问题：

（1）分离病毒的RNA通常在冰浴条件下进行，目的是抑制________________的活性，防止病毒的RNA降解。荧光PCR反应体系中需要加入的酶和原料是________________。为保证反应体系只扩增病毒特异性核酸序列，应先根据病毒的特异性核酸序列设计________________。

（2）荧光染料能掺入DNA双链中发出荧光，在游离状态下不发出荧光。若检测到荧光量达到某个临界值，则代表阳性，说明________________________________。若检测出现“假阴性”现象，原因可能是________________________________。

（3）某病毒的E蛋白和P蛋白会引起机体产生特异性免疫反应。构建重组活病毒载体疫苗时，获取某病毒的________________插入腺病毒的基因组中。通过重组腺病毒感染动物可使其获得免疫力，原因是________________________________________________。

Answer

RNA酶 反转录酶、Taq酶和4种脱氧核苷酸 2种引物 样本中含有病毒的RNA 病毒的RNA在提取过程中发生降解 E基因和P基因 重组腺病毒在动物体内表达E蛋白和P蛋白，刺激动物产生特异性抗体和记忆细胞

【解析】

基因工程技术的基本步骤：

（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。

（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。

（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样.将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。

（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术.个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。

（1）RNA酶可以降解RNA，冰浴条件可以抑制RNA酶的活性防止RNA降解。荧光PCR可以利用RNA扩增反转录DNA，需要的酶有反转录酶、Taq酶，原料是dNTP（dATP、dGTP dCTP、dTTP），样液中可能含病毒的RNA，细胞自身的各种RNA等，为了保证反应体系只扩增病毒特异性核酸序列，应先根据病毒的特异性核酸序列设计2种引物，确保只有病毒的特异性RNA可以扩增，其他RNA不能扩增。

（2）荧光染料能掺入DNA双链中发出荧光，在游离状态下不发出荧光。若检测到荧光量达到某个临界值，说明病毒的RNA在荧光PCR仪中扩增，待测样本中含有病毒的RNA，“假阴性”说明样本中含有病毒的RNA，但是未扩增到能检测出的临界值，可能原因是病毒的RNA在提取过程中发生降解，待测样本中的病毒（核酸）量少。

（3）某病毒的E蛋白和P蛋白可引发机体特异性免疫反应，可以将获取的病毒的E基因和P基因插入腺病毒的基因组中，重组腺病毒在动物体内表达E蛋白和P蛋白，刺激动物产生特异性抗体和记忆细胞，使动物获得免疫力。