Question

基因打靶技术是建立在基因同源重组技术以及胚胎干细胞技术的基础上而发展起来的一种分子生物学技术。请结合图示回答下列有关问题：

注：neo^r 是新霉素抗性基因；tk 基因的表达可以使无毒的丙氧鸟苷代谢为毒性物质，导致细胞死亡。

（1）将目的基因和与细胞内靶基因同源的 DNA 片段都重组到__________上，构建打靶载体（基因表达载体）。

（2）打靶载体测序验证正确后，利用__________酶，将之线性化，以提高重组率。通过__________技术将打靶载体导入胚胎干细胞，这样打靶载体和与细胞内靶基因同源的区段就有机会发生同源重组。

（3）为了筛选发生同源重组的细胞，可在培养液中加入__________。最后还需要通过__________技术鉴定同源重组的细胞（去除靶基因），将这样的细胞通过动物细胞培养后，获得大量打靶成功的细胞。其中， 暂时不用的细胞进行__________保存。

（4）将打靶成功的细胞注射入小鼠囊胚，移植到同种、__________的母鼠体内，一段时间后对受体母鼠进行妊娠检查，确保其生下嵌合体小鼠。这种嵌合体小鼠长大后，体内同时存在被“修饰”过的基因和未被“修饰”的基因。如果某些小鼠的__________（填“体细胞”或“生殖细胞”）恰巧被“修饰”过了，则它们的杂交后代中，就可能出现基因完全被“修饰”过的小鼠。

Answer

载体（或质粒） 限制 显微注射 新霉素和丙氧鸟苷 DNA分子杂交 液氮（或冷冻） 生理状态相同（或经同期发情处理） 生殖细胞

【解析】

基因工程技术的基本步骤：

（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。

（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。

（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。

（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术；个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。

（1）分析题图可知，将目的基因和与细胞内靶基因同源的DNA片段都重组到载体（或质粒）上，构建打靶载体（基因表达载体）。

（2）打靶载体测序验证正确后，利用限制酶，将之线性化，以提高重组率。通过显微注射技术导入胚胎干细胞，这样打靶载体与细胞内靶基因同源的区段就有几率发生同源重组。

（3）neor是新霉素抗性基因，tk基因的表达可以使无毒的丙氧鸟苷代谢为毒性物质，导致细胞死亡，因此为了筛选发生同源重组的细胞，可在培养液中加入新霉素和丙氧鸟苷。最后还需要通过DNA分子杂交技术鉴定同源重组的细胞（去除靶基因），将这样的细胞通过动物细胞（或克隆）培养后，获得大量打靶成功的细胞。其中，暂时不用的细胞进行液氮（或冷冻）保存。

（4）将打靶成功的细胞注射入小鼠囊胚，移植到同种、生理状态相同（或经同期发情）的母鼠体内，一段时间后对受体母鼠进行妊娠检查，确保其生下嵌合小鼠。这种嵌合体小鼠长大后，体内同时存在被“修饰”过的基因和未被“修饰”的基因。如果某些小鼠的生殖细胞恰巧被“修饰”过了，则它们的杂交后代中，就可能出现基因完全被“修饰”过的小鼠。