Question

某生物兴趣小组，进行土壤中尿素分解菌的分离和计数实验。请回答下列问题：

（1）实验原理：尿素是一种重要的农业氮肥，可是并不能直接被农作物吸收，需要转变成氨，才能被吸收，这个转变依赖于土壤中能产生__________的微生物的作用。

（2）实验步骤及结果

Ⅰ：配制培养基（成分：葡萄糖、Na₂HPO₄、KH₂PO₄、MgSO₄·7H₂O、尿素、Y、H₂O、琼脂），并制作无菌平板；

Ⅱ：设置__________组和若干实验组，进行相关操作；

Ⅲ：将各组平板置于恒温箱中培养一段时间，统计各组平板上菌落的平均数。

①为了更好的鉴别出此类微生物，在培养基配方中加入了Y，Y是__________。

②为了对实验的结果进行进一步统计，需要用__________法进行接种。具体情况如下图：

③恒温培养48小时后，在稀释倍数为10⁵下，平板上的菌落数目在30～300之间，小组成员进行统计，应注意统计周围为_________菌落进行记数。统计三个平板的菌落数目，分别为68、73、87，则锥形瓶中每毫升稀释液中，尿素分解菌的活菌数为_________。

Ⅳ：实验结果

兴趣小组的同学在统计菌落数目时，除了上述统计的菌落外，还发现有些菌落周围的培养基没有变化，试分析这些菌落产生的可能原因（答出一点即可）_________。

（3）欲将上述实验得到的尿素分解菌进行长期保存，可采用_________的方法。

Answer

脲酶 空白对照 酚红指示剂 稀释涂布平板 红色的 7.6×106个 可能存在固氮微生物，它们能利用空气中的氮气作为氮源，而不利用培养基中的尿素分解成氨（不与指示剂作用），所以看到有些菌落产生而菌落周围的培养基没有变化 甘油管藏

【解析】

进行土壤中尿素分解菌的分离和计数实验时，应使用以尿素为唯一氮源的培养基，实验设计应遵循对照原则，以排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。

微生物的接种方法中最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法。

对菌种进行保藏时，临时保藏可将菌种接种到试管的固体斜面培养基上，放置在4℃环境保藏；若要长期保存，可使用甘油管藏，将菌液与灭菌后的甘油混合，置于﹣20℃条件保存。

（1）尿素分解菌能产生脲酶将尿素分解成氨，土壤中的尿素只有被分解成氨后才能被植物吸收利用，因此可用以尿素为唯一氮源的培养基来分离尿素分解菌。

（2）Ⅱ：为检验培养基是否受到杂菌污染，需要设置空白对照组。

Ⅲ：①细菌合成的脲酶将尿素分解成了氨，氨会使培养基的碱性增强，pH升高，因此可以通过检查培养基的pH变化来鉴别尿素分解菌的存在，在培养基配方中加入的Y可以是酚红指示剂。②分析图示实验过程可知，采用了稀释涂布平板法进行接种，用于计数土壤稀释液中尿素分解菌的数量。③当尿素分解菌产生的脲酶将尿素分解为氨后，使pH升高，酚红指示剂会变红，因此应注意统计周围为红色的菌落进行计数。在稀释倍数为105下，三个平板的菌落数目分别为68、73、87，因此锥形瓶中每毫升稀释液中尿素分解菌的活菌数为（68＋73＋87）÷3×105＝7.6×106个。

Ⅳ：有些菌落周围的培养基没有变化，说明这些细菌不能产生脲酶进而利用尿素作为氮源，而氮源为微生物生长所必需的，因此可推测可能存在固氮微生物，它们能利用空气中的氮气作为氮源，而不利用培养基中的尿素分解成氨（不与指示剂作用），所以看到有些菌落产生而菌落周围的培养基没有变化。

（3）对于需要长期保存的菌种，可以采用甘油管藏的方法。