Question

利用酵母菌分解废纸是一种环保的方式，但废纸中的纤维素分子量大不能直接进入酵母菌，且酵母菌无法分解利用环境中的纤维素。为解决这一难题，科学家将纤维素酶基因通过重组质粒导入酵母菌。其所用质粒及其酶切位点如下图1，外源DNA上的纤维素酶基因及其酶切位点如图2。请回答下列问题：

（1）图1、图2中的质粒和纤维素酶基因分别作为重组DNA技术中的_______，为使两者能够有效组合，图中可选用的最合适的限制酶是_______。

（2）若质粒被HindⅢ限制酶识别的序列是-AAGCTT -，并在A与A之间切割。请画出被切割后所形成的黏性末端_____________。

（3）科学家进一步构建了含3种不同基因片段的重组质粒，进行了一系列的研究。下图3是酵母菌转化及纤维素酶在工程菌内合成与运输的示意图。

①图3中已导入重组质粒的菌株有______ 。

②设置菌株Ⅰ作为对照，是为了验证_______均不携带纤维素酶基因。

③将4株菌株分别置于以纤维素为_______的培养基上，其中_______两个菌株不能存活。

④据图推测A基因片段的作用是_______。

Answer

运载体和目的基因 Hind III和PstI 菌株Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ 质粒和酵母菌 唯一碳源 菌株Ⅰ和菌株Ⅱ 使纤维素酶可以固定于细胞壁表面

【解析】

1、选择限制酶的方法

(1)根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类

①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。

②不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。

③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)。

(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类

①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致，以确保具有相同的黏性末端。

②质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制酶SmaⅠ会破坏标记基因；如果所选酶的切点不止一个，则切割重组后可能会丢失某些片段，若丢失的片段含复制起点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后将不能自主复制。

2、分析图2可知，纤维素酶基因的两端存在HindⅢ和PstⅠ的酶切位点。使用同一种限制酶切割目的基因和质粒，容易导致目的基因或质粒自身连接；纤维素酶为胞外酶，该酶在核糖体上合成，依次经过内质网和高尔基体加工，最后通过胞吐释放到细胞外。

（1）根据题意可知，将纤维素酶基因通过重组质粒导入酵母菌，则图2中的纤维素酶基因为目的基因，质粒是运载目的基因的运载体。据图2可知，纤维素酶基因中存在BamHⅠ的酶切位点，因此不能选择BamHⅠ切割目的基因；只使用PstⅠ切割目的基因和质粒，可能出现目的基因或质粒的自身连接，因此为使纤维素酶基因能够与质粒有效组合，应选用最合适的限制酶是HindⅢ和PstⅠ。

（2）质粒被Hindlil限制酶识别的序列是一AAGCTT一，并在A与A之间切割磷酸二酯键，则被切割后所形成的黏性末端为和。

（3）①据图3可知，菌株Ⅰ中导入的是普通质粒，菌株Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ中导入的是重组质粒。

②设置菌株I作为对照，根据其不能合成纤维素酶可判断质粒DNA和酵母菌基因组不携带纤维素酶基因。

③筛选可分泌纤维素酶的转基因酵母菌，可将4株菌株分别置于以纤维素为唯一碳源的培养基上。据图可知，菌株Ⅱ中缺少信号肽编码序列，导致所产生的纤维素酶无法分泌到细胞外，分解细胞外的纤维素，使得细胞无可利用的碳源，由于菌株Ⅰ中导入的是普通质粒，其不能合成纤维素酶，不能利用培养基中的碳源，因此菌株Ⅰ和菌株Ⅱ因不能利用纤维素碳源不能存活。

④识图分析可知，图3中菌株Ⅳ导入的重组质粒中含有纤维素酶基因、A基因片段和信号肽编码序列，其与菌株Ⅱ、Ⅲ相比可以看出，分泌的纤维素酶固定于细胞壁表面，因此推测A基因片段的作用使纤维素酶可以固定于细胞壁表面。