Question

回答下列（一）、（二）小题：

（一）日常生活中所使用的生物产品，都是由多种酶经过一系列生化反应的产物。例如用糯米酿酒，就是使用微生物在一定条件下，经过一系列酶促反应获得产物的结果。

（1）首先，糯米中的淀粉在_______的条件下水解成糖，这一过程是由酒曲中的__________产生 的淀粉酶完成的，于是发酵料变甜。然后，在_______________条件下酵母菌经过糖酵解和乙醇发酵反应，产生乙醇。

（2）为获得纯净酵母菌，常常需要用划线分离法获得单菌落。在第二次及以后划线时，总 是从上一次的末端开始划线，这样做的目的是__________________ 。划线的某个平板培养 后，第一划线区域的划线上都不间断的长满了菌落，第二划线区域的第一条线上无菌落，其他划线上有菌落，造成划线无菌落可能的操作失误有________________（至少答两点）。

（3）可用固定化酵母细胞进行酒精发酵。该操作中需使用海藻酸钠，其作用是____________。 选择固定化酵母细胞而不是固定化酶进行酒精发酵的主要原因是________________。

（二）请回答与基因工程有关问题：

（1）基因工程基本操作步骤，一般包括：目的基因的获取→酶切→连接→_______ →筛选→检测基因的表达。其中第一步中，可用_______扩增的方式获得大量基因；第二步中为防止DNA的自连，我们常使用___________的方式进行酶切；第三步连接反应时为提高连接效率，需注意外源目的基因与质粒比例；第四步将重组DNA 导入受体细胞前，常使用Ca²⁺处理大肠杆菌，使之成为____________细胞；第五步筛选含有目的基因的受体细胞，常会 借助载体上____________的表达；第六步检测目的基因是否翻译成了病毒蛋白质，利用的 技术是________。

（2）包涵体，是外源基因在大肠杆菌中高效表达时，形成的由膜包裹的高密度、不溶性蛋白质颗粒，无生物学活性。包涵体形成与胞质内蛋白质生成速率有关，短时间内新生成的多肽浓度过高，无充足的时间进行折叠，易形成包涵体，另外，宿主菌的培养条件，如培养基成分、pH值、离子强度等因素也与此有关。对此我们可以采取的措施是___________，诱导培养时对摇床进行 处理。在下游工艺纯化蛋白时，细菌裂解液的澄清工艺很重要，因为裂解液中颗粒物进入层析柱的柱床中填料间隙，会导致层析柱使用时反压升高，从而导致流速___________，影响整个工艺效率。

Answer

有氧和温度较高 黑根霉或黑曲霉 较低温度和无氧 划线末端的菌液较少，从这里开始划线更有利于加大细菌间的距离，获得单菌落 接种环灼烧后未冷却、第二次划线未从第一次划线末端开始 作为载体利用包埋法固定酵母细胞 酒精发酵需要多种酶的参与，固定化酵母细胞中含有多种酶，实现连续发酵、连续生产的目的 转化 PCR 双酶切 感受态 标记基因 抗原抗体杂交 降温降速 减慢

【解析】

1、固定化细胞优点：成本更低，操作更容易，可以催化一系列的化学反应。缺点：反应物不易与酶接近，尤其是大分子物质，反应效率下降。

2、基因工程技术的基本步骤：

（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。

（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。

（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。

（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因—DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA—分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质—抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。

（一）（1）首先，糯米中的淀粉在有氧和温度较高的条件下水解成糖，这一过程是由酒曲中的黑根霉或黑曲霉产生的淀粉酶完成的，于是发酵料变甜。然后，在较低温度和无氧条件下酵母菌经过糖酵解和乙醇发酵反应，产生乙醇。

（2）由于划线末端的菌液较少，从这里开始划线更有利于加大细菌间的距离，获得单菌落，所以在第二次及以后划线时，总是从上一次的末端开始划线。划线的某个平板培养后，第一划线区域的划线上都不间断的长满了菌落，第二划线区域的第一条线上无菌落，其他划线上有菌落，造成划线无菌落可能的操作失误有接种环灼烧后未冷却，菌种被烫死了，或者是第二次划线未从第一次划线末端开始。

（3）固定化酵母细胞时海藻酸钠的作用是作为载体，利用包埋法固定酵母细胞。酒精发酵过程需要多种酶参与，固定细胞就是固定细胞内的一系列酶，可达到连续生产的目的，而固定化酶只能固定一种或一类酶，只能催化一种化学反应，所以选择固定化酵母细胞而不是固定化相关酶进行酒精发酵。

（二）（1）基因工程基本操作步骤，一般包括：目的基因的获取→酶切→连接→转化→筛选→检测基因的表达。其中获取大量目的基因可用PCR技术扩增。构建基因表达载体时，为防止DNA的自连，常使用双酶切的方式进行酶切；第四步将重组DNA导入受体细胞前，常使用Ca2+处理大肠杆菌，使之成为感受态细胞，易于吸收周围环境中的DNA。第五步筛选含有目的基因的受体细胞，常会借助载体上标记基因的表达；第六步检测目的基因是否翻译成了病毒蛋白质，利用的技术是抗原-抗体杂交。

（2）包涵体形成与胞质内蛋白质生成速率有关，短时间内新生成的多肽浓度过高，无充足的时间进行折叠，易形成包涵体，另外，宿主菌的培养条件，如培养基成分、pH值、离子强度等因素也与此有关。对此我们可以降温降速，降低蛋白质的合成速率。裂解液中颗粒物进入层析柱的柱床中填料间隙，会导致层析柱使用时反压升高，从而导致流速减慢，影响整个工艺效率。