Question

研究发现，肆虐全球的新型冠状病毒（2019-nCoV）为有包膜病毒，基因组为单股正链RNA，长度为29．8Kb。基于其特异性的基因组序列，科研工作者研制的新型冠状病毒核酸检测试剂盒（RT-PCR荧光探针法）为新型冠状病毒感染的肺炎疫情防控提供了快速、简便、精准的核酸检测方案。RT-PCR荧光探针法即实时荧光定量PCR技术（Real Time Quantitative PCR），通过荧光标记的特异性探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，通过仪器和相应的软件分析结果，对待测样品通过检测荧光信号的累积（以Ct值表示）来确定样本中是否有病毒核酸。新型冠状病毒检测的具体操作过程如下图。根据所学知识，请回答下列相关问题：

（1）新型冠状病毒（2019-nCoV）的相关蛋白能在宿主细胞中正常表达的理论基础是________________________________。

（2）该反应体系中，过程①需要用到___________酶，在该体系中使用TaqDNA聚合酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是_______________________。

（3）过程③使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是___________，其作用是破坏了DNA双链分子中的___，引物Ａ、Ｂ的作用是_____________。

（4）采集新冠肺炎疑似患者的咽部细胞样本提取核酸进行上述ＲＴ－PCR过程，每一个扩增出来的DNA序列，都可与预先加入的一段荧光标记探针结合，产生荧光信号，扩增出来的目的基因越多，观察到的Ct值就越_________。

（5）RNA病毒分两类，一类以自身RNA为模板直接进行RNA的复制；另一类以自身RNA为模板逆转录合成DNA，再以DNA为模板合成RNA，即逆转录病毒。请利用同位素标记法设计实验证明新型冠状病毒是否是逆转录病毒________________。（现有放射性同位素标记的胸腺嘧啶脱氧核苷酸及其他必要试剂，请简要写出实验思路）

Answer

生物的遗传物质都是核酸，具有相似的组成成分和结构；遗传信息的传递都遵循中心法则（都遵循碱基互补配对原则）；所有生物共用一套密码子 （2）逆转录酶 Taq酶热稳定性高，而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活 加热至90～95 ℃ 氢键 定位目的基因的位置，与模板链结合并为子链的延伸提供起点 大 实验思路：设法将新型冠状病毒破碎，获取其提取液，置于试管中，向试管中加入适量的放射性同位素标记的胸腺嘧啶脱氧核苷酸、逆转录酶、ATP等原料，并将其放在相同且适宜的温度和pH条件下，一段时间后检测试管中DNA分子放射性的有无。

【解析】

PCR一般要经历三十多次循环，每次循环可分为变性、复性、延伸三步。在循环之前，常需要进行一次预变性，以便增加大分子模板DNA彻底变性的概率。

PCR过程为：

变性，当温度上升到90 ℃以上时，氢键断裂，双链DNA解旋为单链。

复性，当温度降低到50℃左右是，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。

延伸，温度上升到72 ℃左右，溶液中的四种脱氧核苷酸，在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。

（1）生物的遗传物质都是核酸，具有相似的组成成分和结构；遗传信息的传递都遵循中心法则（都遵循碱基互补配对原则）；所有生物共用一套密码子，这是生物具有统一性的表现，正因如此，新型冠状病毒（2019-nCoV）的相关蛋白才能在宿主细胞中进行正常表达。

（2）该反应体系中，过程①为逆转录过程，需要逆转录酶，在该体系中需要使用TaqDNA聚合酶，该酶耐高温，即热稳定性高，而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活，因此在PCR技术中不使用大肠杆菌的DNA聚合酶。

（3）在反应体系中，过程③需要首先加热至90～95℃，此时模板DNA在高温条件下变性，即其中的氢键断裂，解开为单链，接着反应体系中温度降低，两种引物分别与解开的两条单链之间形成氢键完成中温复性的过程，然后体系中温度上升体系中的游离的脱氧核苷酸依次连在引物上开始中温延伸过程，该过程中引物Ａ、Ｂ的作用是定位目的基因的位置，与模板链结合并为子链的延伸提供起点。

（4）题意显示每一个扩增出来的DNA序列，都可与预先加入的一段荧光标记探针结合，产生荧光信号，因此扩增出来的目的基因越多，产生的荧光信号越强，观察到的Ct值就越大。

（5）一类RNA病毒能以自身RNA为模板直接进行RNA的复制；另一类以自身RNA为模板逆转录合成DNA，再以DNA为模板合成RNA，即逆转录病毒。为确定新型冠状病毒是否是逆转录病毒，现要求用同位素标记法设计实验进行证明，因此这里需要使胸腺嘧啶脱氧核苷酸带上放射性标记，具体设计思路如下：首先设法将新型冠状病毒破碎，获取其提取液（其中含模板核酸），置于试管中，向试管中加入适量的放射性同位素标记的胸腺嘧啶脱氧核苷酸以及另外三种脱氧核苷酸、逆转录酶、ATP等原料，并将其放在适宜的条件下，一段时间后检测试管中是否有放射性的DNA分子出现。