Question

为了增加油菜种子的含油量，研究人员尝试将酶D基因与转运肽基因相连，一起导入油菜细胞并获得了转基因油菜品种。 

（1）研究人员依据基因的已知序列设计引物，采用__________法快速扩增从陆地棉基因文库中获取到的酶D基因和从拟南芥基因文库中获取到的转运肽基因。所含三种限制酶（ ClaⅠ、 SacⅠ、 XbaⅠ）的切点如图所示，则用______酶和______酶处理两个基因后，可得到_____端与_____端（填图中字母）相连的融合基因。 

（2）将上述融合基因插入如图所示Ti质粒的T—DNA中，构建_________________________并导入农杆菌中。将获得的农杆菌接种在含__________的固体平板上培养得到含融合基因的单菌落，再利用液体培养基振荡培养，可以得到用于转化的侵染液。 

（3）剪取油菜的叶片放入侵染液中一段时间，此过程的目的是_______，进一步筛选后获得转基因油菜细胞，该细胞通过________技术，可培育成转基因油菜植株。 

（4）用________技术可检测转基因油菜植株中的融合基因是否成功表达。

Answer

PCR ClaⅠ DNA连接 A D 基因表达载体（或“重组质粒”） 四环素 利用农杆菌将融合基因导入油菜细胞 植物组织培养 抗原-抗体杂交

【解析】

基因工程的基本操作程序：

第一步：目的基因的获取

1、原核基因采取直接分离获得，真核基因是人工合成；

2、PCR技术扩增目的基因；

第二步：基因表达载体的构建

第三步：将目的基因导入受体细胞

将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是农杆菌转化法，其次还有基因枪法和花粉管通道法等。

将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是显微注射技术；

将目的基因导入微生物细胞：用Ca2+处理。原核生物作为受体细胞的原因是繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少，最常用的原核细胞是大肠杆菌。

第四步：目的基因的检测和表达。

（1）目的基因的扩增采用PCR技术；由于酶D基因和转运肽基因都有ClaⅠ限制酶切位点，所以可以用ClaⅠ限制酶和DNA连接酶处理两个基因后，得到A、D端相连的融合基因。

（2）将上述融合基因插入图乙所示Ti质粒的T-DNA中，构建表达载体即重组质粒并导入农杆菌中。将获得的农杆菌接种在含四环素的固体平板上培养得到单菌落，再利用液体培养基震荡培养，可以得到用于转化的浸染液。

（3）剪取油菜的叶片放入侵染液中一段时间，此过程的目的是利用农杆菌将融合基因导入油菜细胞，进一步筛选后获得转基因油菜细胞。该细胞通过植物组织培养技术，可培育成转基因油菜植株。

（4）用抗原-抗体杂交法可检测转基因油菜植株中的融合基因是否成功表达。