Question

利用基因工程技术将细菌中已知序列的高赖氨酸蛋白结构基因（pLRP47）转入植物细胞获得高赖氨酸植物新品种，如高赖氨酸莴苣。

（1）从细菌中提取 mRNA，在逆转录酶的作用下形成_____，然后在 DNA聚合酶的作用下得到基因 pLRP47，并利用______进行扩增，用_________酶把经限制性核酸内切酶切割的目的基因和农杆菌Ti质粒进行连接，获得___________。

（2）取摇床中经_____的农杆菌培养液离心并用____________________________________处理以增加细胞壁的通透性。对转化后的农杆菌进行培养使其恢复到_______________状态再使其增殖。

（3）用含重组质粒的农杆菌侵染离体的莴苣细胞经____________过程形成的愈伤组织，重组质粒进入莴苣细胞后，利用____________将 pLRP47 基因整合到染色体DNA中，再用含__________________________的培养基继续培养获得转基因莴苣。

（4）由于转基因生物存在安全性的争议，为了满足人类食物的需求，需发展农业。我国广大农村地区推广的农作物秸秆的“过腹还田”实现了物质的___________________和多途径利用；我们还可利用动物的不同习性，设计多种__________________技术。

Answer

单链 DNA； PCR 技术 DNA连接酶 重组质粒（重组DNA分子） 扩大培养 氯化钙 原来的（正常的） 脱分化 T-DNA 营养物质和植物生长调节剂 良性循环 立体养殖

【解析】

基因工程技术的基本步骤：

（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。

（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。

（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。

（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因—DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA—分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质—抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。

（1）以mRNA为模板，在逆转录酶的作用下形成单链DNA，然后在DNA聚合酶的作用下得到基因pLRP47；体外扩增目的基因可采用PCR技术；将目的基因与运载体连接起来需要用DNA连接酶，从而获得重组质粒（重组DNA分子）。

（2）取摇床中经扩大培养的农杆菌培养液离心并用氯化钙处理以增加细胞壁的通透性，使其容易对周围的DNA分子易于吸收。对转化后的农杆菌进行培养使其恢复到原来的（正常的）状态再使其增殖。

（3）愈伤组织是外植体经过脱分化过程形成的；农杆菌转化法的原理：农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上。因此重组质粒进入莴苣细胞后，利用T-DNA将pLRP47基因整合到染色体DNA中，再用含营养物质和植物生长调节剂的培养基继续培养获得转基因莴苣。

（4）由于转基因生物存在安全性的争议，为了满足人类食物的需求，需发展农业。我国广大农村地区推广的农作物秸秆的“过腹还田”实现了物质的良性循环和多途径利用；我们还可利用动物的不同习性，设计多种立体养殖技术。