Question

下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中箭头表示相关限制酶的酶切位点。请回答下列问题：

限制酶	EcoR Ⅰ	BamH Ⅰ	Sau3AI	SmaⅠ
识别序列及切割位点

（1）一个图1所示的质粒分子经SmaⅠ切割后，含有_______个游离的磷酸基团。

（2）根据限制酶识别和切割的位点，应选择_________________酶对质粒和含目的基因的外源DNA进行切割。用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒，不能用BamH Ⅰ切割，原因是____________________________________________。

（3）通过PCR技术扩增目的基因时，加入的引物有A、B两种，引物A、B序列设计的依据是_______________________，若该目的基因扩增4代，则需要消耗引物A____________个。

（4）为了获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混合，并加入DNA连接酶，若只考虑DNA切段两两连接，则混合物中将形成_______种环状DNA。重组质粒中抗生素抗性基因的作用是为了__________________________________。

Answer

2 EcoRⅠ、SmaⅠ BamHⅠ会破坏外源DNA中目的基因的结构和质粒中抗生素抗性基因的结构 目的基因两端的部分核苷酸序列 15 3 筛选出含有目的基因（或重组质粒）的受体细胞

【解析】

分析图1：质粒上BamHⅠ、SmaⅠ、EcoR I和Sau3AⅠ四种限制酶的识别序列和切割位点，其中BamHⅠ的切割位点位于抗生素抗性基因上。

分析图2：外源DNA上含有BamHⅠ、SmaⅠ、EcoR I和Sau3AⅠ四种限制酶的识别序列和切割位点，其中BamHⅠ的切割序列位于目的基因上。

（1）质粒切割前是双链环状DNA分子，所有磷酸基团参与形成磷酸二酯键，故不含游离的磷酸基团。从图1可以看出，质粒上只含有一个SmaⅠ的切点，因此被该酶切割后，质粒变为线性双链DNA分子，因每条链上含有一个游离的磷酸基团，因此切割后含有2个游离的磷酸基团。

（2）由图1可知，质粒的抗性基因和外源DNA中的目的基因都含有BamHⅠ的切割位点，用BamHⅠ会破质粒的抗性基因和外源DNA中的目的基因，故根据限制酶识别和切割的位点，应选择EcoRⅠ、SmaⅠ酶对质粒和含目的基因的外源DNA进行切割。

（3）通过PCR技术扩增目的基因时，加入的引物有A、B两种，引物A、B序列是依据目的基因两端的部分核苷酸序列来设计，若将1个含目标片段的DNA分子经PCR反应循环n次后，共需要消耗引物的数量为2×2n-2=2（2n-1），则若将1个目的基因扩增4代，则需要引物的数量为2（2n-1）=2×15=30个，其中引物A和引物B各15个。

（4）在构建表达载体的过程中对图中质粒、DNA片段进行合适的完全酶切后，形成的含有2个酶切位点的片段有2种，向两者的混合物中加入DNA连接酶，若只考虑DNA切段两两连接，则混合物中将形成3种环状DNA，重组质粒中抗生素抗性基因的作用是为了筛选出含有目的基因（或重组质粒）的受体细胞。