Question

图1是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图，载体质粒P₀具有四环素抗性基因(tet^r)和氨苄青霉素抗性基因(amp^r)。请回答下列问题：

（1）用Taq DNA聚合酶进行PCR扩增获得的目的基因片段，其两端各自带有一个腺嘌呤脱氧核苷酸。载体P₁用酶处理，在两端各添加了一个碱基为________的脱氧核苷酸，形成P₂；P₂和目的基因片段在________酶作用下，形成重组质粒P₃。

（2）为筛选出含有重组质粒P₃的菌落，采用含有不同抗生素的平板进行筛选，得到A、B、C三类菌落，其生长情况如下表(“＋”代表生长，“－”代表不生长)。根据表中结果判断，应选择的菌落是________(填表中字母)类，另外两类菌落质粒导入情况分别是______________________、________________________。

平板类型 菌落类型	A	B	C
无抗生素	＋	＋	＋
氨苄青霉素	＋	－	＋
四环素	＋	－	－
氨苄青霉素＋四环素	＋	－	－

Answer

胸腺嘧啶(T) DNA连接 C A类菌落含有P0 B类菌落未转入质粒

【解析】

分析题图：P0是载体质粒，其含有的氨苄青霉素抗性基因（ampr）和四环素抗性基因（tetr）都属于标记基因，可以用来检测目的基因是否导入受体细胞；EcoRV酶为限制酶，其切割质粒后会破坏了四环素抗性基因（tetr）。

（1）分析图1可知，目的基因两侧为粘性末端，且游离出的碱基为A，则在载体P1的两端需要各加一个碱基T，形成具有粘性末端的载体P2，再用DNA连接酶将P2与目的基因连接起来形成重组质粒P3。

（2）限制酶切割后破坏了四环素抗性基因，但是没有破坏氨苄青霉素抗性基因，因此含有重组质粒P3的菌落在含有四环素的培养基中不能生长，而在含有氨苄青霉素的培养基中能生长，结合表格分析可知，应该选择C类菌落。根据表格分析，A类菌落在氨苄青霉素和四环素的培养基中都能够生长，说明其导入的是P0；B类菌落在任何抗生素的培养基中都不能生长，说明其没有转入任何质粒。