Question

下图是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图，载体质粒P0具有四环素抗性基因（tet ^r）和氨苄青霉素抗性基因（amp^r）。请回答：

（1）EcoR V酶切P0形成的末端为______末端。

（2）通过PCR扩增获得的目的基因，其两端各自带有一个鸟嘌呤脱氧核苷酸。为了能使载体P1能与目的基因连接，可以用______酶处理，在两端各添加了一个碱基为______的脱氧核苷酸，形成P2。

（3）为筛选出含有重组质粒P3的菌落，采用含有不同抗生素的培养基进行筛选，得到A、B、C三类菌落，其生长情况如下表（“+”代表生长，“﹣”代表不生长）。结果表明，菌落______是符合要求的。

	A	B	C
无抗生素	+	+	+
氨苄青霉素	+	+	-
四环素	+	-	-
氨苄青霉素+四环素	+	-	-

（4）为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。如图所示为甲、乙、丙3条引物在正确的重组质粒中的相应位置。

①引物中A＋T比例越高，PCR过程中退火温度越______。PCR中提供的酶是______。

②某学生用一对引物甲和乙从某一菌落的质粒中扩增出了400bp的片段，原因是______。PCR过程中需要提供引物的原因是______。

Answer

平 DNA聚合酶 胞嘧啶（C） B 低 Taq酶 目的基因反向连接 Taq酶不能从头开始合成DNA，只能从3’端延伸DNA链

【解析】

基因表达载体的基本结构包括复制原点、目的基因、标记基因、启动子、终止子等。根据题干信息和图形分析，P0是载体质粒，其含有的氨苄青霉素抗性基因（ampr）和四环素抗性基因（tetr）都属于标记基因，可以用检测目的基因是否导入受体细胞；EcoRV酶为限制酶，其切割质粒后会破坏了四环素抗性基因（tetr）。

（1）根据图示分析，EcoRV酶切P0形成的线性载体P1为平末端。

（2）据图分析，目的基因两侧为粘性末端，且露出的碱基为G，为了能使载体P1能与目的基因连接，可以用DNA聚合酶处理，在载体P1的两端需要再加一个碱基C（胞嘧啶），形成具有粘性末端的载体P2。

（3）根据以上分析已知，限制酶切割后破坏了四环素抗性基因，但是没有破坏氨苄青霉素抗性基因，因此含有重组质粒P3的菌落在四环素中应该不能生长，而在氨苄青霉素的培养基中能生长，结合表格分析可知，应该选择B类菌落。

（4）①DNA分子中碱基对A与T之间有2个氢键，C与G之间有3个氢键，所以引物中A＋T比例越高，PCR过程中退火温度越低。PCR中提供的酶为热稳定DNA聚合酶（Taq酶）。

②根据题意和图形分析，某同学用图中的一对引物（甲、乙）从某一菌落的质粒中扩增出了400bp的片段，说明其目的基因发生了反向连接，否则扩增出的应该是100 bp的片段。由于Taq酶不能从头开始合成DNA，只能从3’端延伸DNA链，所以PCR过程中需要提供引物。