Question

鸡干扰素是一种具有高效和广谱抗病毒作用的细胞因子，广泛用于动物领域的抗病毒治疗。科研人员将鸡干扰素基因作为目的基因，构建基因表达载体，通过农杆菌介导法导入烟草，以获得抗病毒烟草。下图为科研人员制备能合成鸡干扰素的烟草愈伤组织细胞的流程，①～④表示相关的操作，两种限制酶的识别序列及切割位点如表所示。请回答下列问题：

（1）步骤①中，利用PCR技术扩增干扰素基因时，设计引物序列的主要依据是__________的特定碱基排列顺序。科研人员还在两种引物的一端分别加上了__________和___________（填DNA序列），以便于后续的剪切和连接。为防止酶切产物自身环化，构建表达载体需用两种限制酶，选择的原则是_________。

A．Ti质粒内，限制酶的切割位点应位于T-DNA内

B．目的基因编码蛋白质的序列中，每种限制酶只有一个切割位点

C．酶切后，目的基因形成的两个黏性末端序列不相同

D．酶切后，Ti质粒形成的两个黏性末端序列相同

（2）步骤②所构建的基因表达载体中未标注出的元件还可以有____________，步骤③中需先用____________处理农杆菌以便将基因表达载体导入细胞。

（3）步骤④中，科研人员提取愈伤组织细胞的RNA后，先通过_________获得DNA，再进行PCR扩增，若最终未能检测出干扰素基因，其可能原因是①________________________②_____________________________。

Answer

鸡干扰素基因 GAATTC GGATCC AC 复制原点 钙离子 逆转录 鸡干扰素基因未导入愈伤组织细胞 导入后未转录出mRNA

【解析】

基因工程技术的基本步骤：

（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；

（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；

（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；

（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。

（1）步骤①中，利用PCR技术扩增鸡干扰素基因时，引物应可以和鸡干扰素基因两端的部分核苷酸序列进行碱基互补配对，因此，需要根据鸡干扰素基因两端的部分核苷酸序列来设计引物的碱基序列。据图可知，该转基因过程用EcoR I和BamH I两种限制酶分别切割目的基因和质粒，以避免质粒或目的基因的自身连接，应在两种引物的一端分别加上EcoR I和BamH I的识别序列GAATTC和GGATCC，以便于后续的剪切和连接。为防止酶切产物自身环化，构建表达载体需用两种限制酶，选择的原则为：

A、限制酶的切割位点应位于Ti质粒的T-DNA内，这样能保证目的基因插入到T-DNA中，而后目的基因可随着T-DNA进入受体细胞的染色体DNA中，A正确；

B、目的基因编码蛋白质的序列中不能有种限制酶的切割位点，否则，达不到转基因的目的，B错误；

C、酶切后，目的基因需要形成两个不相同黏性末端，这样能避免自身环化，C正确；

D、酶切后，Ti质粒形成的两个黏性末端序列也不能相同，否则会自身环化，D错误。

故选AC。

（2）基因表达载体中除含有启动子、终止子、标记基因、目的基因和复制原点。据此可知，步骤②所构建的基因表达载体中未标注出的元件还可以有复制原点，复制原点的存在，可以保证目的基因在宿主细胞中复制，步骤③为导入受体细胞，这里的受体细胞是土壤农杆菌，在将基因表达载体导入农杆菌之前，可用钙离子处理农杆菌，以增大细胞壁通透性，提高转化效率。

（3）步骤④为目的基因的检测与鉴定，在该过程中，科研人员首先提取愈伤组织细胞的RNA，然后通过逆转录获得DNA，再进行PCR扩增，若最终未能检测出干扰素基因，其可能原因为：①鸡干扰素基因即便导入了农杆菌，也不一定能导入烟草愈伤组织细胞；②导入烟草愈伤组织细胞的鸡干扰素基因不一定能够正常转录，也可能为转录出的鸡干扰素的mRNA若被水解, 则不能通过逆转录获得鸡干扰素基因。