Question

如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如下图（以EcoR I酶切为例）：

请据图回答问题：

（1）步骤I用的EcoR I是一种__________酶，它通过识别特定的__________切割特定位点。

（2）步骤Ⅱ用的DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3′-羟基与5′-磷酸间形成__________；PCR循环中，升温到95℃是为了获得__________；TaqDNA聚合酶的作用是催化__________。

（3）若下表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是__________（从引物①②③④中选择，填编号）。

	DNA序列（虚线处省略了部分核苷酸序列）
已知序列
PCR引物	①5′- AACTATGCGCTCATGA-3′ ②5′- GCAATGCGTAGCCTCT-3′ ③5′- AGAGGCTACGCATTGC-3′ ④5′- TCATGAGCGCATAGTT-3′

（4）对PCR产物测序，经分析得到了片段F的完整序列。下列DNA单链序列中（虚线处省略了部分核苷酸序列），结果正确的是_________________。

A． 5′- AACTATGCG-----------AGCCCTT-3′

B． 5′- AATTCCATG-----------CTGAATT-3′

C． 5′- GCAATGCGT----------TCGGGAA-3′

D． 5′- TTGATACGO----------CGAGTAC-3′

Answer

限制性核酸内切（或限制） 核苷酸序列 磷酸二酯键 DNA单链 以DNA为模板的DNA链的延伸 ②④ B

【解析】

采用PCR技术扩增DNA的过程为：变性、退火、延伸、终止，PCR技术扩增目的基因的原理：DNA双链复制，引物是一小段单链DNA，引物5′端的碱基可以与DNA两条链的3′端的碱基进行碱基互补配对，可作为DNA复制的起始点，子链的延伸方向从5′→3′。

（1）EcoR I是一种限制性核酸内切酶，它通过识别特定的核苷酸序列切割特定的位点。

（2）DNA连接酶可催化相邻核苷酸之间的3'-羟基和5'-磷酸之间形成磷酸二酯键；PCR循环中，升温到95℃时，DNA受热变性后解旋为单链；Taq DNA聚合酶是一种耐高温的依赖于DNA模板的DNA聚合酶，能催化以DNA链为模板的DNA链的延伸。

（3）引物是一小段单链DNA，引物5'端的碱基可以与DNA两条链的3'端的碱基进行碱基互补配对，可作为DNA复制的起始点，子链的延伸方向从5'→3'，据题图分析，结合已知序列可知，能与片段F左边配对的引物为④，与右边配对的引物为②，故步骤Ⅲ选用的PCR引物应当为②④。

（4）对PCR产物测序，得到片段F的完整序列，因为片段F是被限制酶EcoR I剪切的两端，它识别的序列是GAATTC，且在G与A之间切割，所以5'端应该是AATTC，3'端是GAATT，故选B。