Question

图1表示含有目的基因D的DNA片段长度（bp即碱基对）和部分碱基序列，图2表示一种质粒的结构和部分碱基序列，现有MspI、BamHI、MboI、SmaI 4种限制性核酸内切酶切割的碱基序列和酶切位点分别为C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG，请回答下列问题：

（1）若用限制酶SmaI完全切割图1中DNA片段，其产物长度为_____________。

（2）若图1中虚线方框内的碱基对被T-A碱基对替换，那么基因D就突变为基因d。从隐性纯合子分离出图1及其对应的DNA片段，用限制酶SmaI完全切割，产物中共有____种不同DNA片段。为了提高实验成功率，需要通过_________技术扩增目的基因，以获得大量的目的基因。

（3）若将图2中质粒和目的基因D通过同种限制酶处理后进行，形成重组质粒，那么应选用的限制酶是______________。在导入重组质粒后，为了筛选出含质粒的大肠杆菌，一般先用添加_________的培养基进行培养，然后将生长的菌接种到只含____________的培养基中培养，可进一步筛选出含重组质粒的受体细胞。

（4）假设用BamHI切割DNA获取目的基因，用MboI切割质粒，然后形成重组质粒，若将插入在抗生素B抗性基因处的目的基因重新切割下来，能否用BamHI? _____（能，不能，不一定）。因为目的基因和抗生素B抗性基因拼接处_______________。

Answer

537bp、790bp、661bp 两 PCR BamHⅠ 抗生素B 抗生素A 不一定 不一定出现GGATCC

【解析】

分析题图：外源DNA含有BamHI、MboI、SmaI3种限制性核酸内切酶的识别序列，其中限制酶MspⅠ和SmaⅠ的切割位点在目的基因上。质粒含有MspI、BamHI、MboI3种限制性核酸内切酶的识别序列，其中BamHI酶的切割位点位于抗生素A的抗性基因上；MboI酶的切割位点位于抗生素B和抗生素A的抗性基因上。

（1）图1中DNA片段含有两个SmaⅠ酶切位点，被SmaⅠ酶完全切割后出现三个长度的片段，分别是537bp、790bp、661bp。

（2）D突变成d由于碱基对替换的位置发生在SmaⅠ的位置，所以基因d的序列中含有一个识别位点，经过切割后会产生1327bp和661bp两种长度的片段。为了提高实验成功率，需要通过PCR技术扩增目的基因，以获得大量的目的基因。

（3）限制酶MspⅠ和SmaⅠ的切割位点位于目的基因D上，若用这两种酶切割会被破坏目的基因D；运载体的两个标记基因上都有限制酶MboⅠ的切割位点，用该酶切割会破坏这两个标记基因，因此只能选用限制酶BamHⅠ切割外源DNA分子和运载体；用限制酶BamHⅠ切割质粒会破坏抗生素A抗性基因，但不会破坏抗生素B抗性基因，所以导入重组质粒的大肠杆菌能在含有抗生素B的培养基上生存，因此为了筛选出含重组质粒的大肠杆菌，一般需要用添加抗生素B的培养基培养；然后将生长的菌接种到只含抗生素A的培养基中培养，可进一步筛选出含重组质粒的受体细胞。

（4）用BamHⅠ切割DNA获取目的基因，用MboⅠ切割质粒，然后形成重组质粒，用BamHⅠ不一定将插入在抗生素B抗性基因处的目的基因重新切割下来，因为目的基因和抗生素B抗性基因拼接处含有GATC，不一定出现GGATCC。