Question

MseⅠ、PstⅠ、EcoRⅠ三种限制酶的识别序列及切割位点分别是GAAT↓TAATTC、C↓TGCAG、G↓AATTC，如图1、图2中箭头表示相关限制酶的酶切点。图3表示利用基因工程生产胰岛素的三种途径。图4表示改造哺乳动物遗传特性的三种途径。请据图回答问题。

（1）若要用如图1和图2中的质粒和外源DNA构建重组质粒，需要对质粒进行改造，构建新的限制酶切位点。在构建新的限制酶切位点的过程中需要使用哪些工具酶___________________。

（2）图3中催化过程①的DNA连接酶的作用是促使形成_________________，导入受体细胞B常用方法_______________，④过程也可以培养到______________，再从培养液中提取细胞代谢产物。

（3）图3中导入受体细胞C首先使用Ca²⁺处理使其吸收周围的DNA分子，之后将细胞C与图中M溶于缓冲液中，完成转化过程，其中用Ca²⁺处理的目的是________________。

Answer

限制酶EcoRⅠ、DNA聚合酶、DNA连接酶 磷酸二酯键 农杆菌转化法 愈伤组织 增加细菌细胞壁的通透性

【解析】

分析题图：图1质粒中含有限制酶PstⅠ和EcoRⅠ的切割位点。图2含目的基因的外源DNA中含有限制酶PstⅠ、MseⅠ、EcoRⅠ的切割位点，其中EcoRⅠ酶的切割位点位于目的基因中。图3中①表示基因表达载体的构建，②表示将目的基因导入受体细胞，③表示早期胚胎培养技术，④表示植物组织培养，⑤表示微生物实验室培养。

（1）含目的基因的外源DNA中含有限制酶PstⅠ、MseⅠ、EcoRⅠ的切割位点，其中EcoRⅠ酶的切割位点位于目的基因中，因此构建基因表达载体时，不能用EcoRⅠ酶切割，应该用限制酶PstⅠ、MseⅠ进行切割，则对质粒进行改造时，应该将限制酶EcoRⅠ的切割位点改造成限制酶MseⅠ的切割位点。因此，首先需要用限制酶EcoRⅠ切割，其次需要用DNA聚合酶将相应的脱氧核苷酸序列连接上去，最后再用DNA连接酶连接形成限制酶MseⅠ的切割位点。所以在构建新的限制酶切位点的过程中需要使用限制酶EcoRⅠ、DNA聚合酶、DNA连接酶等工具酶。
（2）DNA连接酶的作用是促使形成磷酸二酯键，导入受体细胞B（莴苣）常用方法为农杆菌转化法，④过程表示植物组织培养，可以培养到愈伤组织，再从培养液中提取代谢产物，原因是细胞代谢强、增殖快。
（3）导入受体细胞C（大肠杆菌）首先使用Ca2+处理，目的是增加细菌细胞壁的通透性，使其容易吸收周围的DNA分子，之后将细胞C与图中M（基因表达载体）溶于缓冲液中，完成转化过程。