Question

鸡干扰素是一种具有高效和广谱抗病毒作用的细胞因子，广泛用于动物领域的抗病毒治疗。科研人员将鸡干扰素基因作为目的基因，构建基因表达载体，通过农杆菌介导法导入烟草，以获得抗病毒烟草。回答问题：

(1)目的基因合成后可在Taq酶的作用下通过PCR技术大量扩增，该技术的原理是________________________。利用PCR技术扩增干扰素基因时，需要加入两种引物，原因是_____________________________________。

(2)基因表达载体中应有RNA聚合酶识别和结合的部位，该部位称为_________________。将基因表达载体导入农杆菌常用的方法是___________________________________。

(3)该实验中，将农杆菌转入烟草细胞的原生质体，原生质体再生出细胞壁。请从理论角度提出实验室检测原生质体是否再生出细胞壁的一种方法：________________________。

(4)科研人员提取烟草愈伤组织细胞的RNA后，先通过__________获得DNA，再进行PCR扩增。若最终未能检测出干扰素基因，可能原因是____________________；若转基因烟草植株对病毒的侵染表现出一定的抗性，但抗性较低，可能原因是__________________。

Answer

DNA的热变性（或DNA双链复制） DNA两条链反向平行，DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链，用两种引物才能确保DNA两条链同时扩增 启动子 感受态细胞法（或Ca2+转化法） 将细胞置于高渗溶液中，用显微镜观察细胞是否发生质壁分离（或将细胞置于清水中，用显微镜观察细胞是否胀破） 逆转录 鸡干扰素基因未能导入烟草愈伤组织细胞（或导入烟草愈伤组织细胞的鸡干扰素基因未能转录） 转基因烟草体内干扰素的合成量较低（或合成的干扰素生物活性低）

【解析】

1、基因工程技术的基本步骤：

（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。

（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。

（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。

（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。

2、PCR技术扩增目的基因：①原理：DNA双链复制；②过程：第一步：加热至90～95℃DNA解链；第二步：冷却到55～60℃，引物结合到互补DNA链；第三步：加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始互补链的合成。

（1）利用PCR技术扩增干扰素基因时，依据的原理是DNA双链复制的原理，设计引物序列的主要依据是干扰素基因两条链两端的部分核苷酸序列，由于DNA两条链反向平行，而DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA子链，用两种引物才能确保DNA两条链同时扩增。

（2）基因表达载体必需具备的成分有目的基因、标记基因、启动子、终止子和复制原点，其中启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，将基因表达载体导入农杆菌（微生物）时，常用Ca2+处理，使其处于感受态，因此将基因表达载体导入农杆菌的方法是Ca2+转化法。

（3）根据题意，该实验中将农杆菌转入烟草细胞的原生质体后，需再生细胞壁，实验室检测原生质体是否再生出细胞壁，可以将细胞置于高渗溶液中，观察是否发生质壁分离，如果发生质壁分离说明新的细胞壁已经形成。

（4）提取的愈伤组织细胞的RNA通过逆转录过程得到DNA；最终未能检测出干扰素基因，可能是因为鸡干扰素基因未能导入烟草愈伤组织细胞或导入烟草愈伤组织细胞的鸡干扰素基因未能转录。若转基因烟草植株对病毒的侵染表现出一定的抗性，但抗性较低，说明转基因烟草体内干扰素的合成量较低或者合成的干扰素生物活性低。