Question

目前基因工程所用的质粒载体主要是以天然细菌质粒的各种元件为基础重新组建的人工质粒，pBR322质粒是较早构建的质粒载体，其主要结构如图一所示：

 

（1）构建人工质粒时要有抗性基因，以便于___________________。

（2）对目的基因进行扩增的常用方法是PCR，该技术所依据的原理是__________________，PCR扩增某目的基因时需要引物___________种，扩增时，每个循环一般需要经过“变性、退火、延伸”三个过程，其中______过程的温度设定是扩增成败的关键。PCR中用到的酶为 _____________ 酶。

（3）若用噬菌体替代质粒作为运载体构建基因表达载体的过程中，是否需要利用CaCl₂处理大肠杆菌，制备感受态细胞_______（需要  不需要） ，原因是_______________ 。

（4）用BamHI处理目的基因和质粒后用DNA连接酶连接获得重组质粒，为了检测该重组质粒是否导入原本无amp^R和tet^R的大肠杆菌，将大肠杆菌在含氨苄青霉素的培养基上培养，得到如图二的菌落。再将灭菌绒布放到培养基上，使绒布面沾上菌落，然后将绒布放到含四环素的培养基上培养，得到如图三的结果(空圈表示与图二对照无菌落的位置)。与图三空圈相对应的图二中的菌落表现型是 _____________________________图三结果显示，少数大肠杆菌导入的是 ______________ 。

Answer

鉴别目的基因是否导入受体细胞 DNA双链复制 2 退火 Taq酶 不需要 噬菌体能通过侵染过程将自身的DNA注入到大肠杆菌中 能抗氨苄青霉素，但不能抗四环素 重组质粒（基因表达载体）

【解析】

基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。

（1）质粒上的抗性基因常作为标记基因，其作用是鉴别目的基因是否导入受体细胞。
（2）PCR技术的原理是DNA双链复制。PCR扩增某目的基因时需要2种引物，扩增时，每个循环一般需要经过“变性、退火、延伸”三个过程，其中退火过程的温度设定是扩增成败的关键。PCR中用到的酶为Taq 酶，该酶耐高温。
（3）由于噬菌体能通过侵染过程将自身的DNA注入到大肠杆菌中，因此用噬菌体替代质粒作为运载体构建基因表达载体的过程中，不需要利用CaCl2处理大肠杆菌，制备感受态细胞。
（4）用BamHⅠ处理目的基因和质粒后用DNA连接酶连接获得重组质粒，由于BamHⅠ处理质粒后破坏了四环素抗性基因，但没有破坏氨苄青霉素抗性基因，因此成功导入重组质粒的大肠杆菌能能抗氨苄青霉素，但不能抗四环素，即图三空圈对应的图二中的菌落能抗氨苄青霉素，但不能抗四环素。图三中空圈较少，这说明少数大肠杆菌导入的是重组质粒（基因表达载体）。